一種新型ATP食品衛(wèi)生檢測儀的研制

1、引言

食品安全是一個直接關(guān)系到人民群眾生命健康和社會穩(wěn)定的重大公共安全問題，而細(xì)菌性污染又是其中極為重要的因素。如何能夠快速、有效的檢測食品中細(xì)菌的含量，是當(dāng)今食品安全必然涉及的技術(shù)課題。目前檢測細(xì)菌含量的主要方法如下：

（1）傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法：傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測被稱為“金標(biāo)方法”，但其培養(yǎng)時間長且對檢測條件以及檢測人員的專業(yè)水平要求較高。

（2）ATP(三磷酸腺苷)生物化學(xué)發(fā)光法：利用細(xì)胞的特征來測定細(xì)菌數(shù)，是快速檢測菌落總數(shù)的一個發(fā)展方向。這種方法可以在幾分鐘內(nèi)得出結(jié)果，大大縮短了檢測時間。

（3）其他檢測方法：除了上述兩種檢測方法外，還有許多檢測方法正在迅速發(fā)展。其中包括免疫學(xué)方法，分子生物學(xué)方法以及其他生物化學(xué)方法[1]。這些檢測方法各有千秋，但許多檢測方法或因設(shè)備試劑比較昂貴、或因操作過程復(fù)雜、或因?qū)嶒灄l件較為嚴(yán)格，不適用于食品衛(wèi)生狀況的現(xiàn)場檢測。

可見ATP生物化學(xué)發(fā)光法具有極大的優(yōu)點。但是目前大部分ATP衛(wèi)生檢測儀采用了光電倍增管（PMT）作為熒光探測器[2-3]，閃光型熒光素酶作為檢測試劑，導(dǎo)致體積較大，價格昂貴，僅適合實驗室的驗證工作，極大的限制了其在食品生產(chǎn)衛(wèi)生檢測過程中的應(yīng)用。為了克服其缺點，本文采用新型硅光電二極管作為熒光探測器，輝光型熒光素酶作為檢測試劑，設(shè)計出一種新型的ATP食品衛(wèi)生檢測儀，具有便攜性、功耗低、高靈敏度和速度快的優(yōu)點。

2、ATP生物化學(xué)發(fā)光檢測方案

2.1 ATP生物化學(xué)發(fā)光檢測原理

ATP是包括微生物在內(nèi)的一切活生物細(xì)胞能量的來源。它在蟲熒光素酶的催化作用下，與熒光素在有氧環(huán)境及二價鎂離子的作用下釋放出熒光，其反應(yīng)式為[4]：

強(qiáng)度呈線性關(guān)系，用光度計測出發(fā)光強(qiáng)度，也就得到了細(xì)菌總數(shù)[5]。這種方法可以在幾分鐘內(nèi)得到結(jié)果，大大縮短了檢測時間。

2.2 ATP生物發(fā)光酶的選擇

當(dāng)前商業(yè)化的ATP螢火蟲熒光素-蟲熒光素酶主要分為閃光型和輝光型兩種：

（1）閃光型（Flash） 光在幾秒鐘內(nèi)就能發(fā)射完。發(fā)光過程中光強(qiáng)很快到達(dá)峰值然后迅速下降（1-3s）[2]。

（2）輝光型（Glow） 有些商業(yè)化的熒光素酶檢測系統(tǒng)采用特殊的方法，使得酶的活性高，產(chǎn)生的光強(qiáng)度強(qiáng)，在測試的幾分鐘之內(nèi)可以保持穩(wěn)定。

由于閃光型發(fā)光持續(xù)時間短，對此類型光進(jìn)行測試必須要采用自動加樣系統(tǒng)，這使得檢測儀的體積增大，攜帶不方便，不利于對食品生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行實時現(xiàn)場檢測。本文采用輝光型酶作為檢測試劑，只要在兩分鐘之內(nèi)對試樣檢測即可，不需要自動加樣系統(tǒng)克服了閃光型酶的缺點。

3、系統(tǒng)設(shè)計

3.1 硬件設(shè)計

儀器的硬件部分主要由取樣測試室、電源模塊、微弱熒光檢測模塊、校準(zhǔn)模塊、單片機(jī)控制模塊、通信模塊和人機(jī)對話模塊等部分組成。儀器硬件結(jié)構(gòu)如圖1所示。

此測試儀在設(shè)計過程中面臨的兩個突出的難點在于儀器近乎苛刻的超低功耗要求和對超微弱熒光的檢測。針對這兩點，本文對電源模塊和微弱熒光檢測模塊采取如下設(shè)計方案。

（1）電源模塊 由于儀器的便攜特性，采用兩節(jié)普通的1.5V堿性電池作為儀器的電源。利用具有電池反接保護(hù)功能的升壓開關(guān)電源芯片MAX1833，將電池電壓轉(zhuǎn)化整個硬件系統(tǒng)的3.3V工作電壓，和最大150mA的電流輸出。此芯片靜態(tài)電流為4μA，關(guān)斷電流小于1μA，電源轉(zhuǎn)換效率高達(dá)90%。

微弱熒光檢測模塊需要精度和穩(wěn)定性要求更高的電源供電，本文選用美國國家半導(dǎo)體公司生產(chǎn)的低壓差線形穩(wěn)壓芯片LP2982，可提供精準(zhǔn)的3V電壓和最大50mA的電流輸出，具有輸出電壓精度1%，低噪聲和關(guān)斷電流小于1μA等特點。電源模塊電路如圖2所示。

以上供電模塊的設(shè)計，具有電源轉(zhuǎn)換效率高，靜態(tài)漏電流低等優(yōu)點。計算證明這樣的設(shè)計可使儀器待機(jī)長達(dá)6個月。

（2）微弱熒光檢測模塊 傳統(tǒng)ATP檢測儀采用PMT作為光電傳感器，對試樣所發(fā)出的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測。由于PMT工作時需要正負(fù)高壓電源供電，使得用其作為光電探測器的衛(wèi)生檢測儀體積較大且價格昂貴，不方便攜帶，極大的限制了此種檢測儀的應(yīng)用。本文采用日本濱松生產(chǎn)的s1227系列硅光電二極管作為光電傳感器，具有體積較小，靈敏度高，暗電流小等優(yōu)點。與PMT相比，硅光電二極管本身沒有電流的放大作用，因此需要設(shè)計良好的放大電路將光電二極管輸出的微弱電流進(jìn)行放大。本文采取以下兩種措施，很好的解決了微弱電流信號的放大問題：

① 選用高性能的集成運算放大器 本文采用ADI公司生產(chǎn)的AD8605運算放大器芯片作為放大器。此放大器具有偏置電壓低，輸入電流低（pA級），電壓電流噪聲低等優(yōu)點，是光電二極管放大電路的最佳選擇。光電二極管采用光伏模式，可以非常精確的線性工作，無暗電流，整個電路的噪聲低。

② 對整個微弱熒光檢測模塊進(jìn)行屏蔽 本文采用的特殊設(shè)計的鋁殼進(jìn)行屏蔽的方法取得了很好的效果。信號放大后，由具有16位Δ-ΣA/D轉(zhuǎn)換器的MAX1407數(shù)據(jù)采集芯片進(jìn)行采樣。整個信號調(diào)理電路如圖3所示。

此外，放大器的增益漂移也是一個必須考慮的問題。本文設(shè)計了校準(zhǔn)模塊來解決此問題：

光電二極管內(nèi)阻和反饋電阻R的溫度特性會導(dǎo)致整個電路的放大倍數(shù)隨著溫度而變化。本文采用綠光LED（發(fā)射出560nm左右的光，與ATP生物化學(xué)發(fā)光光譜非常匹配）作為校準(zhǔn)光源來解決此問題。LED發(fā)光具有穩(wěn)定的低漂移，在一定范圍內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度與電流成正比。設(shè)電流為I1，I2為通過LED的電流，放大電路輸出電壓分別為V1，V2，利用公式（1）：

可以計算出當(dāng)前環(huán)境下的放大系數(shù)β，與標(biāo)準(zhǔn)放大倍數(shù)相乘就可以得到當(dāng)前放大倍數(shù)。此校準(zhǔn)模塊，具有自動校準(zhǔn)的特點，不需要人工干預(yù)。

采用6鍵簿膜開關(guān)作為儀器的輸入部分，輸出部分為字符型LCD。具有打印接口以及與上位機(jī)進(jìn)行通信的RS232接口。按鍵少，界面友好，操作簡單。

3.2 軟件設(shè)計

由于整個系統(tǒng)功能比較復(fù)雜，為了充分利用系統(tǒng)的硬件資源，方便對程序的管理以及升級，儀器采用μC/OS-II嵌入式操作系統(tǒng)管理整個軟件系統(tǒng)。整個軟件系統(tǒng)采用三層結(jié)構(gòu)，由內(nèi)向外分別是操作系統(tǒng)層、應(yīng)用層、硬件層，如圖4所示。

應(yīng)用層是依據(jù)系統(tǒng)的基本功能以及對硬件的依賴來劃分的。主要有以下五個任務(wù)：信號采集處理任務(wù)、命令處理任務(wù)、顯示任務(wù)、數(shù)據(jù)存儲任務(wù)和通信任務(wù)。根據(jù)自身的性質(zhì)和對實時性要求的不同，應(yīng)對這五項任務(wù)分配不同的優(yōu)先級。

（1）信號采集處理任務(wù) 控制MAX1407對試樣的發(fā)光值進(jìn)行采樣并對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。是整個系統(tǒng)的核心，在本系統(tǒng)中具有最高優(yōu)先級。平時處于掛起狀態(tài)，由命令處理任務(wù)激活,數(shù)據(jù)采集完成后，激活數(shù)據(jù)存儲任務(wù)，然后掛起。

（2）命令處理任務(wù) 根據(jù)鍵值和系統(tǒng)當(dāng)前所處狀態(tài)激活其他任務(wù)，任務(wù)優(yōu)先級較高，在本系統(tǒng)中處于第二優(yōu)先級。

（3）顯示任務(wù) 在LCD上實時顯示各種數(shù)據(jù)及狀態(tài)，任務(wù)優(yōu)先級較高，為第三優(yōu)先級。

（4）數(shù)據(jù)存儲任務(wù) 通過SPI總線與25AA640芯片進(jìn)行通信，存儲檢測數(shù)據(jù)。

（5）通信任務(wù) 與上位機(jī)通信，傳送檢測數(shù)據(jù)或接收上位機(jī)命令。

系統(tǒng)運行時，首先進(jìn)行系統(tǒng)初始化操作，即初始化所有數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，分配堆?？臻g，然后建立任務(wù)間通信的信號量或者消息郵箱，進(jìn)而創(chuàng)建任務(wù)，所有任務(wù)被置于就緒態(tài)。多任務(wù)環(huán)境開始運行，命令處理任務(wù)根據(jù)鍵盤狀態(tài)激活其他任務(wù)，從而實現(xiàn)系統(tǒng)的各個功能。

4、測量結(jié)果與分析

常見的微生物如真菌類，其ATP含量的數(shù)量級為10-11mol/細(xì)胞，細(xì)菌類為10-18mol/細(xì)胞[5]。根據(jù)食品生產(chǎn)過程中對環(huán)境衛(wèi)生的要求，本儀器的設(shè)計目標(biāo)是能夠準(zhǔn)確檢測10-15-10-11mol的ATP。當(dāng)ATP的量在此范圍時，儀器應(yīng)該具有良好的重復(fù)性和線性。

為了測試儀器的性能，采用美國普洛麥格公司生產(chǎn)的輝光型熒光素-熒光素酶作為檢測試劑，將配置的不同量的ATP標(biāo)準(zhǔn)液（10-16-10-7mol）加入到螢火蟲-熒光素酶中，用儀器進(jìn)行測量。為了避免偶然性，對不同數(shù)量級的ATP量進(jìn)行多次試驗。將測到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，繪制不同物質(zhì)的量的ATP與發(fā)光值的對應(yīng)曲線如圖5所示：

可以看出，發(fā)光曲線明顯的分為三個部分，下面分別對這三個部分進(jìn)行分析：

（1）區(qū)域A 此部分發(fā)光量隨ATP量的增加而稍微增加但不成線性關(guān)系。這是因為儀器和酶存在背景噪聲，當(dāng)ATP的量很小時，發(fā)出的光十分微弱，被背景噪聲淹沒。

（2）區(qū)域B 在此區(qū)域內(nèi)發(fā)光量與ATP的量成7個數(shù)量級的線性關(guān)系。因此，可以用發(fā)光值作為評判ATP量的方法之一。

（3）區(qū)域C 在此區(qū)域內(nèi)的ATP量大，而參與反應(yīng)的酶的含量一定，造成ATP剩余，發(fā)光量漸趨飽和。

由測量曲線可以得出，本文所設(shè)計的ATP食品衛(wèi)生檢測儀在檢測10-15-10-11mol量的ATP時，具有良好的線性和可重復(fù)性，達(dá)到了設(shè)計要求。因此，本檢測儀可以實現(xiàn)對細(xì)菌含量的現(xiàn)場快速檢測。

5、結(jié)論

本儀器采用ATP生物化學(xué)發(fā)光法與嵌入式系統(tǒng)相結(jié)合的方法，使得對微生物含量的檢測時間大大縮短，只需要兩分鐘即可得到測試結(jié)果。特別由于采用硅光電二極管作為光電傳感器，解決了通常使用PMT光電倍增管體積大，價格昂貴，不方便攜帶的缺點。測試儀的體積小，方便攜帶，功耗低，待機(jī)時間長，檢測精度高，能夠方便的對試樣進(jìn)行實時檢測，在食品生產(chǎn)衛(wèi)生檢測領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。