新奇的光電生物傳感器SiPM

　　傳感器變送與應用

　　很多種生物應用都涉及熒光技術。特別是在DNA-Chip光學檢測中，熒光團與靶分子(待測分子)結合，再與探針(錨定在玻片上的一個DNA鏈)雜交，然后使用光學掃描儀檢測DNA.本文的目的是推薦使用一個新奇的傳感器替代傳統(tǒng)檢測系統(tǒng)，該傳感器基于硅光電倍增管或SiPM,即將若干個固態(tài)光電檢測器排成像素陣列;另一個目的是研究新型熒光染料。硅光電倍增管由像素數(shù)量不同(25-400個像素)的陣列組成，用于在各種溶液中檢測CY5和Ru(bpy)32+染料的熒光，為硅光電倍增管在DNA-Chip測量中的應用創(chuàng)造了機會。

　　1. 前言

　　硅光電倍增管(SiPM)是一種創(chuàng)新的Geiger模式的固態(tài)光電檢測器。硅光電倍增管結構是若干個相等的單個像素并排組成的陣列，每個像素都是一個集成降壓電阻的硅p-n結雪崩光電二極管(SPAD) [1]。所有像素都并聯(lián)至一個統(tǒng)一的輸出點，因此，輸出信號是各個像素產(chǎn)生的信號的總合，并與光子碰撞的單元數(shù)量成正比[2]。硅光電倍增管是一個很有前景的光電檢測解決方案，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)光電倍增管(PMT)，該技術的某些特性引起人們的興趣，例如，對磁場不敏感的特性使之適用于強磁場工作環(huán)境;穩(wěn)健性和可靠性高于傳統(tǒng)光電倍增管;工作電壓更低，價格更便宜，反應速度更快，尺寸更小。高速[3]、高靈敏度和小尺寸讓硅光電倍增管成為最佳的便攜應用光電檢測器。當然，在各種應用領域，生物傳感器是最令人期待的目標應用，不過，作為熒光檢測器，硅光電倍增管被推薦用于生物傳感器的文獻并不是很多[4-5]。基于DNA-Chip的解決方案通過熒光測量方法同時測定大量基因的表達量[6]。CY3和CY5(發(fā)射波長分別為570 nm和670 nm)是標記DNA目標的傳統(tǒng)熒光團。

　　本文探討了CY5參考標記熒光團和Ru(bpy)32+創(chuàng)新熒光團。其中，Ru(bpy)32的某些獨有特性使其可以替代傳統(tǒng)熒光團，成為新的備用熒光團。事實上，該熒光團的最大吸收波長和最大發(fā)射波長分別為450 nm (金屬配體轉(zhuǎn)移)和630 nm [7],這一間隔范圍可簡化熒光檢測器設計，準許使用價格低廉的低功率LED管代替昂貴的激光管。而且，該熒光團壽命比CY5更長(360 ns對1÷3ns)，我們再次建議光源使用LED (壽命比激光器更長)。最后，在系統(tǒng)集成方面，信號控制電路設計可能變得更簡單。

　　有很多問題能影響集成光電檢測系統(tǒng)的實現(xiàn)，為發(fā)現(xiàn)所有的問題，本文設定一個雙重探討目標：將熒光團作為溶液參數(shù)(鹽水與染料溶液的濃度)加以研究;探討硅光電倍增管在測量生物樣本熒光過程中的性能表現(xiàn)。

　　2. 實驗儀器工具

　　A.待測產(chǎn)品描述

　　本文中的被測硅光電倍增管是意法半導體卡塔尼亞(意大利)研發(fā)中心研制的多片光電檢測解決方案[2].該多片方案共有7個光電檢測器，其中像素數(shù)量從1個到400個。具體地說，單像素檢測器(圖1g)1個，而25像素(圖1:a和 d)、100像素(圖1:b和 e)和400像素(圖1:c和 f)點陣式檢測器各有兩個，(按尺寸劃分)分為有光溝槽和無光溝槽兩類[8]。為了對所選器件施加偏壓，采集輸出信號，多片光電倍增管被焊接到一個敞開的32引腳封裝內(nèi)。

　　圖1:多片光電倍增管結構圖，其中a、b、c和d、e、f分別代表 5×5、 10×10、20×20像素有溝槽和無溝槽光電檢測器;g是單像素光電檢測器。

　　B.樣品制備

　　將CY5 (取自iCycler iQ Calibrator Dye Solution Set #170-8792, Bio-rad) 和 100μg/ml Ru(bpy)32+置于三種不同的溶濟中： H2O milliQ、PBS (磷酸鹽緩沖鹽水) 0.1 M和 PBS 0.01 M.。CY5被稀釋成30%和40%兩種濃度。PBS是一種用NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4制成的鹽水溶液。若需要，加適量稀鹽酸(HCl)或氫氧化鈉(NaOH)，將pH值調(diào)到7.2。PBS用于測試鹽的存在對染料熒光的影響，我們發(fā)現(xiàn)，在黑暗條件下，取每種溶液2 μl,置于玻片(選擇玻片的原因是其厚度為0.13-0.16 mm)上，形成直徑幾毫米的液滴。將玻片樣品置于干燥器內(nèi)，風干30分鐘(30‘)。

　　C.測量儀器

　　我們用下面圖2所示的儀器工具測定樣品發(fā)射的熒光信號。激光二極管(相干立方體激光器) 負責發(fā)射光線，PC機控制發(fā)射光。發(fā)射光在撞擊樣本前，被濾波器衰減30 dB。我們使用兩個660 nm 或403 nm波長的激光二極管分別激發(fā)CY5和Ru(bpy)32+.測定照射樣品的激光的功率，該功率是電激光二極管功率的一個函數(shù)。當電激光功率在10-80 mW 時，照射樣品的激光的功率在11-113 μW之間。

　　圖2:測量儀器工具

　　硅光電倍增管設為連續(xù)工作模式，并連至Keithley 236源測量儀，將硅光電倍增管置于角度計上，以便讓操作人員能夠觀察不同發(fā)射角的熒光信號。樣本置于激光二極管的同一光軸上，光線正常照射樣本表面。將硅光電倍增管用作光子計數(shù)器，使用脈沖工作模式檢測非常微弱的熒光信號。用安捷倫脈沖發(fā)生器Agilent 81110A驅(qū)動激光二極管取得的脈沖激光波形(周期10ms,波長4 ns)測量CY5樣本發(fā)射的光子。在這種情況下，同樣讓激光正常照射置于同一光軸上的樣本，將硅光電倍增管與激光二極管置于同一平面上，且與激光管光軸的夾角為60°，用硅光電倍增管檢測樣本發(fā)射的熒光。該指定角度可確保被檢測到的光噪聲 (玻片反射的激光) 最低。向硅光電倍增管施加-30V或 -32V偏壓。若需要更高的信號強度，則施加更高的偏壓。用示波儀(Tektronix DPO7104)記錄檢測到的信號，通過專門開發(fā)的Labview軟件采集信號，在PC機上使用Matlab軟件對信號進行后分析。　　3. 測試結果與分析討論

　　A. 器件定性分析

　　該多片方案內(nèi)的光電檢測器全都具有光電特性[9].我們的目標是確定最佳的信噪比[10],測量了該器件的反向電流-電壓 (I-V)特性和暗計數(shù)數(shù)量(DC)，即在無光照條件下由被檢測到的熱生成載波引發(fā)的雪崩(計數(shù))。圖3a所示是5×5 (綠線)、10×10 (藍線)、20×20 (紅線)像素點陣有溝槽光電檢測器在室溫條件下的典型反向I-V特性。圖3b所示是暗計數(shù)測量結果，暗計數(shù)測量就是對硅光電倍增管施加-30V偏壓，然后通過歸一化計算取得的像素數(shù)量。通過直接比較不同陣列，我們發(fā)現(xiàn)兩個明顯的主要特性：所有測試條件中擊穿電壓(BV)相同，如果像素數(shù)量增加，則器件噪聲(暗電流和暗計數(shù))隨之提高[8]。BV (-28V)和 -35 V區(qū)間是Geiger模式工作的目標范圍。在這個區(qū)間，暗電流隨著像素數(shù)量增加而線性提高，這種現(xiàn)象在圖3b第一個區(qū)間 (0.5 #p.e.)更為明顯 。

　　圖3 (a) 25像素 (綠線)、100像素 (藍線)、400像素 (紅線)有溝槽硅光電倍增管的反向 I-V特性; (b) 25像素 (綠線)、100像素 (藍線)、400像素 (紅線)有溝槽硅光電倍增管的暗計數(shù)特性

　　當只有一個單元計數(shù)時，所有器件的暗計數(shù)相同，這證明反向電流的上升呈線性。在圖3b的第2區(qū)間(1.5 #p.e.)，硅光電倍增管的三個器件呈現(xiàn)不同的特性，兩個像素光電檢測器同失效，5×5像素有光溝槽器件是硅光電倍增管中暗計數(shù)最少的光電檢測器，這表示其串擾概率最低，因此信噪比最高。這個結果讓我們將25像素光電檢測器定義為最符合我們目標的器件。

　　B. 樣品定性分析

　　為研究熒光特性和生物傳感器性能，我們采取了多種測量方法(見實驗)。圖4描述了在室溫時兩個熒光染料在20°-90°位置的熒光特性。值得一提的是，圖中電流值是熒光信號電流減去參考樣品(玻片)電流測量值的凈電流。圖4還描述了兩種不同濃度的CY5溶液(圖4a)和Ru(bpy)32+ (圖 4b)的熒光特性。硅光電倍增管偏壓為-30V,激光功率為72μW.在測試分析中，出現(xiàn)了一些值得注意的結果：CY5濃度增加導致熒光電流測量值增加，信號值在兩種熒光團的滿量程內(nèi)基本上是常數(shù)，證明熒光信號的各向同性發(fā)射特性[11]; milliQ水溶液是確保熒光凈電流(圖中沒有顯示)最大的最佳溶液。若想解釋Ru(bpy)32+是熒光團溶液濃度的函數(shù)，還需要進一步研究探索。最后，我們用H2O milliQ水溶液制成濃度30%的CY5溶液，然后用硅光電倍增管的光子計數(shù)工作模式，測量該樣品發(fā)射的光子數(shù)量。這個測量過程分為兩個步驟：在硅光電倍增管上施加-32V偏壓，分析參考樣品(頂部無CY5沉淀物)和 CY5樣品。在第一種情況中，示波器采集的信號是硅光電倍增管的固有噪聲和玻片反射的激光輻射產(chǎn)生的殘余噪聲(在這種工作條件下非常低)。然后，我們將CY5沉淀樣品置于激光二極管的同一光軸上，在示波器屏幕上，進入連續(xù)模式，可以看到不同振幅的信號，因為平均4個像素被光子射中。圖5詳細描述了捕獲的數(shù)據(jù)。具體地說，藍實線表示發(fā)射光子的分布，而紅實線則表示從參考樣品捕獲的噪聲。多達6個光子照射傳感器工作區(qū)，在光電頻譜中測量到的熒光峰值間隔代表一個像素提供的電量。硅光電倍增管增益(G) 為輸出電荷Qto與被檢測到的光子nph和電子電荷(q)的比值：

　　G=Qtot/nph·q ---------- (1)

　　假設平均一個光子引發(fā)一個像素雪崩，則增益的表達式如下：

　　G=Qpixel/q= CD ·(VBIAS - VBD) /q ---------- (2)

由于在-32V偏壓下，CD 通常是在 10 - 100 fF范圍內(nèi)，所以，假設nph=1,VBD = -28V,單個光電頻譜內(nèi)的峰值間隔測量值大約是3.50·10-13,對應的增益值為2.2·106.不過，當硅光電增管偏壓上升時，記錄的增益和噪聲測量值都會提高，