Science | 清華大學(xué)和南京農(nóng)大揭示植物抗病基因PGIPs作用機(jī)制

2024年2月15日，Science在線發(fā)表了由清華大學(xué)和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)合作的研究內(nèi)容“A plant mechanism of hijacking pathogen virulence factors to trigger innate immunity”。本研究表明，植物在響應(yīng)病原體入侵過程中，參與抑制病毒聚半乳糖醛酸酶活性的基因PvPGIP2與FpPG（聚半乳糖醛酸酶）的相互作用主要包括兩個方面：

1.抑制FpPG酶的活性，促進(jìn)FpPG水解PGA產(chǎn)生更多的長鏈低聚半乳糖醛酸酯，同時減少短鏈低聚半乳糖醛酸酯的產(chǎn)生，進(jìn)一步可以促進(jìn)PTI的產(chǎn)生；

2.PvPGIP2結(jié)合到上FpPG上之后產(chǎn)生一個底物結(jié)合位點(diǎn)，其底物結(jié)合活性增強(qiáng)，底物偏好改變?；诮Y(jié)構(gòu)工程可以將最初缺乏FpPG結(jié)合活性的推定PGIP轉(zhuǎn)化為有效的FpPG相互作用蛋白。

具體的研究內(nèi)容如下：

研究背景：

植物細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素和果膠組成，是抵御病原體侵襲的主要和關(guān)鍵屏障。病原體分泌各種細(xì)胞壁降解酶（CWDEs），如聚半乳糖醛酸酶，以解聚細(xì)胞壁多糖，并隨后破壞細(xì)胞壁的完整性。聚半乳糖醛酸酶由各種病原體產(chǎn)生，它們在發(fā)病機(jī)制中的作用已經(jīng)得到了很好的證實(shí)。病原性和某些植物源性聚半乳糖醛酸酶屬于內(nèi)糖苷水解酶28家族（內(nèi)聚半乳糖醛酸酶）。這些酶非特異性地水解細(xì)胞壁中α-1,4連接的聚半乳糖醛酸（PGAs，果膠的去酯化高半乳糖醛酸）的糖苷鍵。為了抵消CWDE的酶活性，植物表達(dá)了一系列CWDE抑制蛋白，包括PGIPs。此外，植物已經(jīng)進(jìn)化出細(xì)胞膜上的模式識別受體（PRRs）來識別CWDEs和/或它們釋放的細(xì)胞壁片段作為損傷相關(guān)的分子模式，從而誘導(dǎo)模式觸發(fā)免疫（PTI）。例如，擬南芥PRRs壁相關(guān)激酶（WAKs）識別聚合度為10至15度的長鏈低聚半乳糖醛酸酯（OG10-15），作為PTI激發(fā)子。因此，病原體多半乳糖醛酸酶在破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以增強(qiáng)毒力和向植物發(fā)出信號以觸發(fā)防御反應(yīng)方面具有雙重作用。

PGIPs是富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）蛋白家族的成員，廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物中。作為多半乳糖醛酸酶的特異性和高親和力受體，最具特征的PGIP, Phaseolus vulgaris isoform 2 （PvPGIP2），可以識別幾種真菌多半乳糖醛酸酶，包括葉根鐮刀菌多半乳糖醛酸酶（FpPG）。CWDE抑制蛋白以一種保守的機(jī)制結(jié)合CWDE的活性位點(diǎn)。PvPGIP2被提出結(jié)合活性位點(diǎn)裂縫使FpPG和炭疽菌多半乳糖醛酸酶1 （CluPG1）失活。除了限制聚半乳糖醛酸酶的破壞潛力外，PGIP-PG相互作用還促進(jìn)了體外和表達(dá)PGIP-PG嵌合體的轉(zhuǎn)基因擬南芥中誘導(dǎo)活性低聚半乳糖醛酸酯的積累。炭黑菌多半乳糖醛酸酶1 （ClPG1）的酶活性對于產(chǎn)生煙草防御反應(yīng)的激發(fā)子至關(guān)重要。PGIPs在提高抗病性方面的有效性已在多種作物中得到證實(shí)，包括小麥和水稻。然而PGIPs的作用機(jī)制仍不清楚。

研究結(jié)果：

一、PvPGIP2改變FpPG催化的低聚半乳糖醛酸酯長鏈和短鏈比例

1.確定PvPGIP2與FpPG之間存在相互作用

為了重建PvPGIP2和FpPG之間的相互作用，作者在昆蟲細(xì)胞中分別表達(dá)了這兩種蛋白。凝膠過濾和分析性超離心實(shí)驗(yàn)表明，這兩個蛋白在pH 5.0下形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，分子比為1:1（圖1A和B）。等溫滴定量熱法（ITC）進(jìn)一步證實(shí)了PvPGIP2-FpPG的相互作用，F(xiàn)pPG與PvPGIP2的解離常數(shù)（Kd）為15 nM（圖1C）。堿性條件（pH 8.0）完全破壞了PvPGIP2FpPG相互作用，這表明PvPGIP2可能在植物免疫應(yīng)答的早期階段發(fā)揮作用。鹽濃度的增加略微降低了它們的結(jié)合親和力。

2.確定PvPGIP2與FpPG之間的相互作用確實(shí)會影響PTI的程度

先前描述的高性能陰離子交換色譜脈沖安培檢測（HPAEC-PAD）測定用于研究以PGA為底物，在PvPGIP2存在或不存在的情況下，F(xiàn)pPG催化的低聚半乳糖醛酸產(chǎn)物的大小分布。與之前的數(shù)據(jù)一致，添加PvPGIP2降低了FpPG催化的PGA水解，表現(xiàn)為生成更多的OG>9和更少的OG<9（圖1D）。酶學(xué)特征數(shù)據(jù)支持PvPGIP2抑制FpPG酶活性。

OG10-15激活廣泛的PTI防御反應(yīng)，因此作者首先用FpPG測試了PGA消化產(chǎn)物的PTI誘導(dǎo)活性。接種大豆疫霉P6497前，用dH2O、OG10-15、FpPG+PGA或FpPG- PvPGIP2 +PGA處理大豆黃化下胚軸24小時。接種P649748小時后，用FpPG-PvPGIP2+PGA或OG10-15處理的黃化下胚軸沒有明顯的疾病發(fā)展癥狀。相比之下，用dH2O、PGA或FpPG+PGA預(yù)處理的黃化下胚軸可以觀察到明顯的疾病癥狀（圖1E）。與此一致，F(xiàn)pPG-PvPGIP2+PGA或OG10-15處理的黃化下胚軸中P6497的生物量顯著降低（圖1F）。FpPGPvPGIP2+PGA或純OG10-15比FpPG+PGA或單獨(dú)使用PGA處理中活性氧（ROS）的產(chǎn)生（圖1G）和大豆PTI標(biāo)記基因細(xì)胞色素P450 93家族（GmCYP93）的表達(dá)（圖1G）程度更大。FpPG-PvPGIP2+PGA更強(qiáng)的PTI誘導(dǎo)活性進(jìn)一步通過分析擬南芥中胼膜沉積（圖1I和J）和PTI相關(guān)基因WRKY DNA結(jié)合蛋白40 （WRKY40）、植物恢復(fù)素缺陷3 （PAD3）、鈣調(diào)蛋白樣41 （CML41）和AtPGIP1的表達(dá)得到證實(shí)（圖1K）。

圖1.PvPGIP2-FpPG產(chǎn)生誘導(dǎo)活性低聚半乳糖醛酸酯

3.影響PTI程度的主要是短低聚半乳糖醛酸酯

FpPG+PGA混合物含有大量短OGs（圖2A），已被證明可以抑制小麥的防御反應(yīng)。為了測試合成的短低聚半乳糖醛酸酯是否影響植物免疫，作者對OG2-7，OG5-7或OG3對大豆中不同病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和OG10-15激活的PTI反應(yīng)的影響進(jìn)行測試。OG2-7、OG5-7或OG3預(yù)孵育24小時，顯著抑制了大豆中flg22、幾丁質(zhì)、疫霉1 （INF1）或OG10-15誘導(dǎo)的氧化爆發(fā)產(chǎn)生（圖2B）和防御基因GmCYP93、致病相關(guān)蛋白2 （GmPR2）和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶2 （GmACS2）（圖2C）的表達(dá)。與OG10-15相比，OG2-7、OG5-7或OG3在大豆中沒有引發(fā)ROS的產(chǎn)生（圖2B）。這些結(jié)果表明，短的低聚半乳糖醛酸酯可以作為PTI信號傳導(dǎo)的一般抑制劑，盡管其潛在機(jī)制尚不清楚。FpPGPvPGIP2+PGA混合物也含有短的低聚半乳糖醛酸酯（OG<9），這一觀察結(jié)果可以解釋為什么FpPG-PvPGIP2+PGA引發(fā)的免疫反應(yīng)比OG10-15弱得多（圖1,E至H）。

圖2.FpPG產(chǎn)生免疫抑制劑低聚半乳糖醛酸酯

二、PvPGIP2N274D-FpPG的整體結(jié)構(gòu)及識別機(jī)制

最初試圖結(jié)晶PvPGIP2-FpPG復(fù)合物的努力失敗了，可能是因?yàn)樘腔瘯蓴_分泌蛋白的結(jié)晶。PvPGIP2-FpPG突變復(fù)合蛋白的一個預(yù)測糖基化位點(diǎn)PvPGIP2 Asn274被Asp取代（PvPGIP2N274D）成功結(jié)晶。用分子置換法求解晶體結(jié)構(gòu)，并將其細(xì)化為1.93 ?。

晶體中，PvPGIP2N274D與FpPG形成1:1的配合物，埋面為1087.1 ?2（圖3A）。FpPG折疊成右側(cè)平行的β螺旋，這是典型的果膠甲基酯酶、水解酶和裂解酶的結(jié)構(gòu)。β螺旋包含10個完整的三股或四股螺旋，它們具有不同的大小和構(gòu)象，從核心區(qū)域伸出。預(yù)測的FpPG D191、D212和D213的活性位點(diǎn)殘基位于第3圈（T3）環(huán)上。PvPGIP2N274D的結(jié)構(gòu)包含10個串聯(lián)重復(fù)的LRRs（圖3A），與其他植物中含有LRR的蛋白一樣，折疊成右手超螺旋。FpPG結(jié)合的PvPGIP2N274D的構(gòu)象與游離的PvPGIP2幾乎相同，這表明與FpPG的相互作用不會引起PvPGIP2N274D的構(gòu)象變化。1匝（T1）環(huán)區(qū)和c端側(cè)平行的β鏈（PB） 2a在很大程度上介導(dǎo)了FpPG與PvPGIP2N274D的N端內(nèi)表面的相互作用（圖3A）。相互作用使PvPGIP2N274D的C端靠近FpPG的β螺旋2至5的長T3環(huán)，導(dǎo)致FpPG頂部活性位點(diǎn)關(guān)閉，并在PvPGIP2N274D-FpPG復(fù)合物中形成活性位點(diǎn)隧道（圖3B）。

PB2a垂直包裹在PvPGIP2N274D的N端5條β鏈上。PvPGIP2N274D的四個芳香殘基與FpPG的接觸主導(dǎo)了該區(qū)域周圍的相互作用（圖3C）。來自PvPGIP2N274D第一個LRR的Asp56通過與FpPG Asp250和Asn279形成分叉氫鍵進(jìn)一步加強(qiáng)了相互作用（圖3C）。除了PB2介導(dǎo)的相互作用外，三個T1環(huán)進(jìn)一步促進(jìn)了PvPGIP2N274D-FpPG相互作用（圖3D）。來自β-螺旋9的FpPG Gly314與PvPGIP2 Val152疏水接觸，而FpPG的Asn313、Gly343、Ser344和Lys316與PvPGIP2 Tyr105相互作用（圖3C）。PvPGIP2 Thr177和Phe201在β-螺旋7/8的T1中心區(qū)域進(jìn)行了組裝（圖3D）。FpPG的Ala274位于該區(qū)域但難以接近（圖3D）。在FvPG中，F(xiàn)pPG Ala274突變?yōu)轶w積較大的Thr274，從而消除了PvPGIP2-FpPG相互作用。相反，T274A足以賦予FvPG與PvPGIP2相互作用的能力。Gln224對于PvPGIP2與FpPG的相互作用很重要，它與FpPG Asn304和FpPG Ser272分別在-β螺旋9和β-螺旋8中建立了雙齒氫鍵（圖3D）。FpPG Asn304也與PvPGIP2 Phe269形成范德華接觸（圖3D）。與PvPGIP2相互作用至關(guān)重要的FpPG殘基在其他PvPGIP2結(jié)合的聚半乳糖醛酸酶中大部分是保守的。相比之下，PvPGIP2中關(guān)鍵的FpPG相互作用殘基在不同植物的PGIPs中保守性較差，特別是在非豆科植物中。

接下來，作者對PvPGIP2和FpPG進(jìn)行了氨基酸替換，并使用ITC評估了這些突變對PvPGIP2-FpPG相互作用的影響。Y105E預(yù)計會破壞與FpPG殘基簇的相互作用（圖3C），將PvPGIP2與FpPG結(jié)合的結(jié)合親和力降低了900倍。與FpPG T1中心區(qū)域相互作用的PvPGIP2 Phe201突變（圖3D）類似地?fù)p害了PvPGIP2-FpPG相互作用（圖3C）。PvPGIP2 V152E破壞了與FpPG β-helix9的相互作用，以Kd ~2.57 mM結(jié)合FpPG，效率比野生型PvPGIP2低約170倍。PvPGIP2 β8（圖3D）下的FpPG Thr275突變使FpPG與Tyr的PvPGIP2結(jié)合親和力降低了2000多倍。HPAEC-PAD分析表明，這些PvPGIP2-FpPG突變蛋白在水解PGA時產(chǎn)生的低聚半乳糖醛酸譜與單獨(dú)的FpPG相似。

擬南芥多半乳糖醛酸酶側(cè)根（PGLR）的多半乳糖醛酸酶活性已被證實(shí)。PGLR的C端部分，對應(yīng)于FpPG的PvPGIP2接觸表面，被一個額外的C端的α螺旋完全阻斷，這在其他一些假定的擬南芥多半乳糖醛酸酶中是保守的。因此，ITC沒有發(fā)現(xiàn)PGLR和AtPGIP1之間的相互作用。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了FpPG C端與PvPGIP2相互作用的相關(guān)性。然而單個PGIP可以采用不同的PG抑制機(jī)制。

圖3.PvPGIP2不阻斷FpPG的活性位點(diǎn)

三、PvPGIP2促進(jìn)免疫活性低聚半乳糖醛酸酯產(chǎn)生的機(jī)制

阻斷活性位點(diǎn)被認(rèn)為是PGIP抑制聚半乳糖醛酸酶的機(jī)制。然而，PvPGIP2不結(jié)合FpPG的活性位點(diǎn)（圖3B）。已知PvPGIP1和PvPGIP2具有PGA結(jié)合活性。ITC實(shí)驗(yàn)表明PGA，而不是其他多糖，在pH 5.0時結(jié)合PvPGIP2。PGA的結(jié)合活性，在其他物種的PGIPs中是保守的，在pH 8.0時完全被消除，但與Ca2+無關(guān)。OG10-15和PvPGIP2之間沒有相互作用，可能是因?yàn)樵赑GA中發(fā)現(xiàn)的21/31螺旋結(jié)構(gòu)不能在OG10-15中有效形成，但對PvPGIP2識別PGA至關(guān)重要。

PGA結(jié)合活性表明PvPGIP2與FpPG形成復(fù)合物時，可以增強(qiáng)FpPG對底物的結(jié)合親和力。為了量化FpPG和PvPGIP2-FpPG的底物結(jié)合親和力，使用PGA水解能力嚴(yán)重受損的FpPGH234K變體來最大限度地減少底物降解。由于分子量未知，PGA結(jié)合FpPGH234K無法通過ITC準(zhǔn)確定量。因此選擇了市售的OG10-15作為PGA的代理。雖然OG10-15與PvPGIP2之間沒有相互作用，但PvPGIP2-FpPGH234K顯示出比FpPGH234K （圖4A）更高的OG10-15結(jié)合親和力（圖4A）。相比之下，低聚半乳糖醛酸酯（OG5-7）與PvPGIP2-FpPGH234K的親和力要弱得多。正如預(yù)期的那樣，在相同的條件下，OG5-7和FpPGH234K之間沒有相互作用。這些結(jié)果表明，酶活性較低的FpPG變體可能更有效地產(chǎn)生較長的低半乳糖醛酸酯。事實(shí)上，F(xiàn)pPGH234K或FpPGH234A仍然保留了殘余的PGA水解活性，比野生型FpPG產(chǎn)生更多的長鏈低聚半乳糖醛酸酯（圖4B）。FpPGH234K或FpPGH234A催化活性聚半乳糖醛酸酯的產(chǎn)生在大豆（圖4C至F）和擬南芥（圖4G至I）中得到了證實(shí)。與FpPGH234K或FpPGH234A相比，PvPGIP2-FpPGH234K或PvPGIP2-FpPGH234A沒有PGA水解活性（圖4B）。

FpPGH234K或FpPGH234A催化產(chǎn)物的免疫誘導(dǎo)活性低于PvPGIP2-FpPG降解產(chǎn)物。這一結(jié)果表明，除了抑制外，其他機(jī)制也可能參與促進(jìn)PvPGIP2-FpPG產(chǎn)生免疫活性低聚半乳糖醛酸酯。PvPGIP2表面上由Arg183、Arg206、Lys230和Arg252組成的帶正電簇是PGA結(jié)合所必需的。該簇在不同植物物種的PGIPs中是保守的，但它不參與與FpPG的相互作用（圖4J）。該簇位于FpPG-PvPGIP2活性位點(diǎn)通道的連續(xù)體中，表明它是底物結(jié)合酶復(fù)合物活性位點(diǎn)的一部分（圖4J）。四殘基丙氨酸（PvPGIP24A）同時突變極大地削弱了FpPGH234K-PvPGIP2的OG10 -15結(jié)合親和力（圖4A）。相比之下，OG5-7與FpPGH234K-PvPGIP2的結(jié)合被完全消除。HPAEC-PAD分析表明，F(xiàn)pPG- PvPGIP24A或FpPGH234K-PvPGIP24A產(chǎn)生的低聚半乳糖醛酸酯的大小分布與FpPG或FpPGH234K催化的低聚半乳糖醛酸酯相似（圖4B），這表明PvPGIP2突變消除了對FpPG的抑制作用。綜上所述，這些結(jié)果表明PvPGIP2在PvPGIP2- FpPG復(fù)合物中創(chuàng)建了一個底物結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)優(yōu)先結(jié)合OG10-15而不是OG5-7。

圖4.pvpgip2促進(jìn)免疫活性低聚半乳糖醛酸酯產(chǎn)生的機(jī)制

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