華中農(nóng)大劉繼紅團(tuán)隊(duì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組+代謝組揭示柑橘抗寒新物質(zhì)

柑橘是世界最重要的水果作物屬之一，但許多柑橘品種對(duì)寒冷壓力敏感。宜昌橙（Citrus ichangensis），一種耐寒的柑橘品種，具有識(shí)別對(duì)柑橘耐寒性至關(guān)重要的有價(jià)值代謝物的巨大潛力。然而，調(diào)節(jié)宜昌橙耐寒性的代謝變化和潛在機(jī)制在很大程度上仍然未知。2024年6月14日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉繼紅教授課題組在Plant Physiology上發(fā)表了題為“Transcriptome and metabolome atlas reveals contributions of sphingosine and chlorogenic acid to cold tolerance in Citrus”的研究論文，揭示了鞘氨醇和綠原酸在柑橘抗寒中的重要功能。

研究結(jié)果

1.與HB柚相比，宜昌橙具有更強(qiáng)的耐寒性

為了評(píng)估耐寒性，宜昌橙和HB柚子幼苗被進(jìn)行了冷處理（-4℃，8小時(shí)）。八小時(shí)的冷脅迫后，與宜昌橙相比，HB柚子出現(xiàn)了嚴(yán)重的水浸和明顯的葉片萎蔫（圖1A）。Fv/Fm比率降低。相比之下，宜昌橙植物僅受到輕微的冷脅迫影響（圖1B，E）。冷脅迫后，宜昌橙植物的電解質(zhì)泄漏（EL）和丙二醛（MDA）水平顯著低于HB柚子，表明宜昌橙的細(xì)胞損傷較?。▓D1C-D）。在冷處理后，宜昌橙中積累的ROS水平遠(yuǎn)低于HB柚子（圖1F）。這些結(jié)果表明，與HB柚子相比，宜昌橙表現(xiàn)出了更高的耐寒性。

圖1 與HB柚相比，宜昌柚具有更強(qiáng)的耐寒性

2.代謝組分析

為了探索宜昌橙和HB柚子在冷脅迫下與冷相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)的差異，對(duì)葉片進(jìn)行了非靶代謝組分析?？偣茶b定出512種代謝物，包括124種黃酮類化合物、69種酚酸、63種氨基酸及其衍生物、62種其他物質(zhì)種萜類化合物和1種單寧（圖2A）。相同時(shí)間點(diǎn)上，宜昌橙檢測(cè)到了更劇烈的變化。宜昌橙積累了顯著更高水平的黃酮類化合物、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、木脂素和香 豆素以及萜類化合物。主成分分析（PCA）顯示，512種代謝物可以根據(jù)每個(gè)物種分為兩組，與層次聚類分析一致（圖2B）。在冷處理后12小時(shí)（上調(diào)11種，下調(diào)19種）、24小時(shí)（上調(diào)19種，下調(diào)46種）和72小時(shí)（上調(diào)32種，下調(diào)42種）分別在HB中鑒定出30、65和74種DAMs（圖2C）。同樣，在宜昌橙在冷處理后12小時(shí)（上調(diào)11種，下調(diào)14種）、24小時(shí)（上調(diào)10種，下調(diào)26種）和72小時(shí)（上調(diào)32種，下調(diào)25種）暴露于冷處理時(shí)鑒定出25、36和57種DAMs。通過(guò)韋恩圖來(lái)展示兩種物種之間不同和共有的代謝物（圖2D）。結(jié)果顯示，物種內(nèi)共同積累的代謝物數(shù)量較多，物種間代謝物積累模式存在顯著差異。綜合這些數(shù)據(jù)表明，宜昌橙和HB柚子對(duì)低溫的反應(yīng)表現(xiàn)出不同的代謝物積累模式，可能與它們不同的耐寒能力有關(guān)。利用k-means聚類算法將372種差異積累的代謝物分為12個(gè)不同的聚類(圖2E)。對(duì)12個(gè)聚類的分析表明，兩種柑橘(2類)的冷脅迫誘導(dǎo)的代謝物主要由糖和醇組成，這些代謝物在植物的非生物脅迫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，突出了它們作為保守的應(yīng)激反應(yīng)代謝物的重要性。冷處理的宜昌木瓜中有三類特定代謝物(3,4和10類)的大量積累，而在HB柚中沒(méi)有觀察到明顯的變化。其中，脂質(zhì)(鞘脂、溶磷脂酰膽堿(LPC)、溶磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰膽堿(PC))、氨基酸及其衍生物(苯丙氨酸、酪氨酸等)、核苷酸及其衍生物(胞苷、8-羥基鳥苷等)和3種黃酮類(野柳葉素、橘皮素、紫葉黃素)在冷處理下特異性積累，部分脂質(zhì)(游離脂肪酸)顯著減少。8類代謝物在低溫下顯著增加，而在HB柚中則相反。最后，12類的大多數(shù)代謝物在兩種之間存在顯著差異。具體來(lái)說(shuō)，這類代謝產(chǎn)物在HB柚中被誘導(dǎo)，但在宜昌木瓜中發(fā)生了微小的變化。與HB柚相比，除了典型的應(yīng)激相關(guān)代謝途徑(類黃酮、糖和醇合成、酚酸合成)外，宜昌橙還表現(xiàn)出了與脂質(zhì)、氨基酸和核苷酸代謝相關(guān)的dam的特異性和顯著富集。因此，假設(shè)這些代謝物的生物合成和代謝的差異賦予了宜昌橙更強(qiáng)的抗寒性。

圖2 宜昌橙與HB柚的差異代謝組分析

3.轉(zhuǎn)錄組分析

對(duì)代謝相同樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)分析。PCA顯示，前兩個(gè)主成分可以清楚地區(qū)分分析的24個(gè)樣本（圖3A）。相關(guān)性分析顯示每個(gè)處理中的三個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間有明顯的相似性，表明數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性（圖3B）。兩種基因型在冷脅迫適應(yīng)反應(yīng)中涉及的關(guān)鍵代謝途徑的轉(zhuǎn)錄重編程的差異分析顯示，宜昌橙中有1102個(gè)共同DEGs，在HB柚子中有1861個(gè)共同DEGs在低溫條件下。在這些DEGs中，有433個(gè)是宜昌橙特有的，而1192個(gè)是HB柚子獨(dú)有的。KEGG分析顯示，這些物種特異性DEGs主要參與HB柚子中的黃酮類化合物生物合成途徑，而在宜昌橙中，特定基因主要富集在脂質(zhì)代謝、苯丙烷生物合成和氨基酸生物合成途徑中。WGCNA共鑒定出12個(gè)共表達(dá)模塊（圖3E），宜昌橙中優(yōu)先表達(dá)的基因主要包含在紅色和綠色模塊中。模塊-性狀相關(guān)性的熱圖（圖3F）表明，紅色模塊中基因的表達(dá)與宜昌橙特有的代謝物（包括Nobiletin、Tangeretin和鞘脂類，它們被歸類在上述的類別4中）相關(guān)。此外，棕色模塊中的基因與與海藻糖、半乳糖醇、蔗糖和Nystose相關(guān)的代謝物表現(xiàn)出相關(guān)性，這些也被確定為參與非生物脅迫反應(yīng)的主要保守化合物。與代謝物積累動(dòng)態(tài)一致，黑色和綠色模塊中的基因在宜昌橙的冷處理下被誘導(dǎo)?？傊?，我們的數(shù)據(jù)揭示了代謝物產(chǎn)生與基因表達(dá)變化之間的強(qiáng)相關(guān)性，表明它們可以用來(lái)研究參與冷脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵代謝途徑的調(diào)控。

圖3 冷脅迫下宜昌木瓜(YCC)和HB柚(HB)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的變化

4.鞘氨醇在增強(qiáng)耐寒性中起著關(guān)鍵作用

脂質(zhì)是細(xì)胞膜的重要組成部分，在冷脅迫下的功能已得到證實(shí)。宜昌橙和HB柚子之間脂質(zhì)積累差異較大，作者重點(diǎn)關(guān)注鞘氨醇類，包括二氫鞘氨醇和4-羥基鞘氨醇（圖4A）。在鞘氨醇處理的幼苗中檢測(cè)到更低的電解質(zhì)泄漏（EL）和丙二醛（MDA），表明維持了更穩(wěn)定的膜系統(tǒng)。這些發(fā)現(xiàn)表明鞘氨醇顯著減輕了冷誘導(dǎo)的傷害。基于WGCNA分析，鑒定了紅色模塊中的三個(gè)基因（Cg7g001680、Cg2g009930和Cg7g021070），其中CiSPT，SPT（Cg7g001680）在宜昌橙中的同源基因，顯示出最顯著的轉(zhuǎn)錄豐度（圖4A）。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析顯示SPT與33個(gè)與應(yīng)激相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有強(qiáng)相關(guān)性，包括ERF、WRKY、bHLH和其他轉(zhuǎn)錄因子家族（基于WGCNA權(quán)重> 0.38）（圖4B），表明SPT在冷響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

為了探索SPT（Cg7g001680）在耐寒性中的作用，通過(guò)VIGS敲低了CiSPT。在冷處理下，與TRV系相比，VIGS系表現(xiàn)出嚴(yán)重的水浸和葉片萎蔫癥狀（圖4C）。TRV-CiSPT系的葉綠素?zé)晒夂虵v/Fm比率更低，電解質(zhì)泄漏和MDA含量顯著更高（圖4D-G）。向TRV-CiSPT外源供應(yīng)5 mM鞘氨醇顯著改善了VIGS系的冷敏感表型（圖4C-G）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CiSPT在鞘氨醇積累和增強(qiáng)耐寒性中發(fā)揮關(guān)鍵的積極作用。

圖4 CiSPT基因的沉默降低了宜昌茄子的耐寒性

5.綠原酸(CGA)通過(guò)清除活性氧增強(qiáng)抗寒性

對(duì)物種特有的和與時(shí)間無(wú)關(guān)的差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行了KEGG分析。433個(gè)DEGs與宜昌橙的壓力響應(yīng)途徑有關(guān)，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號(hào)通路、脂質(zhì)代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷生物合成（圖5A-B）。鑒于苯丙烷途徑在植物壓力響應(yīng)中的關(guān)鍵作用，對(duì)兩種物種中與代謝相關(guān)的代謝物和基因進(jìn)行了全面分析。發(fā)現(xiàn)綠原酸（CGA）是一種以前未被識(shí)別的參與柑橘冷響應(yīng)的代謝物（圖5C）。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羥化酶（C4H）和4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）是與核心和特殊代謝都相關(guān)的關(guān)鍵酶，為許多下游代謝物提供前體。羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（HCT/HQT）是催化CGA生物合成的酶。冷處理誘導(dǎo)編碼PAL、C4H、4CL和HCT/HQT的基因在宜昌橙中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于HB柚子。CGA在冷脅迫下顯著誘導(dǎo)，與HB柚子相比，宜昌橙中的含量顯著更高（圖S8）。HB幼苗在冷處理前先用CGA（5 mM）預(yù)處理，與未處理的植物相比，外源性CGA的應(yīng)用顯著提高了HB幼苗的耐寒性。在宜昌橙中通過(guò)VIGS抑制CiHCT2（與CGA積累高度相關(guān)的HCT（Cg3g004640）同源基因）表達(dá)。與TRV對(duì)照相比，TRV-CiHCT2系中的CiHCT2轉(zhuǎn)錄豐度顯著降低（圖S10）。同時(shí)，VIGS植物的CGA水平顯著低于對(duì)照。暴露于冷脅迫（-4℃，8小時(shí)）后，TRV-CiHCT2植物表現(xiàn)出比對(duì)照更敏感的冷表型，同時(shí)電解質(zhì)泄漏和MDA水平顯著更高，葉綠素?zé)晒夂虵v/Fm比率更低（圖6A-F）。VIGS系在葉片中的ROS積累量通過(guò)DAB和NBT的組織化學(xué)染色比TRV對(duì)照顯著更多（圖6G-H）。向TRV-CiHCT2植物外源施用CGA在很大程度上恢復(fù)了它們的表型和生理指標(biāo)，以及顯著增加的內(nèi)源性CGA水平（圖6F）。這些結(jié)果表明，CiHCT2的敲低擾亂了CGA的積累和ROS清除，導(dǎo)致耐寒性受損。

圖5 綠原酸(CGA)生物合成途徑的調(diào)控

圖6 基因CiHCT2的沉默降低了宜昌橙的耐寒性

研究結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)宜昌橙和HB柚子在低溫處理前后的代謝組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，揭示了在冷脅迫下顯著積累的共有和基因型特異性代謝物。研究發(fā)現(xiàn)，糖類、黃酮類和不飽和脂肪酸等物質(zhì)在兩種柑橘中均有積累，但宜昌橙中的含量顯著高于HB柚子。此外，宜昌橙還特異性地積累了一些與脂質(zhì)代謝、苯丙烷代謝和氨基酸代謝途徑相關(guān)的代謝物，這些物質(zhì)可能在宜昌橙的抗寒性中起到了獨(dú)特的作用。同時(shí)，宜昌橙中還特異性地高積累了核苷酸及其衍生物、吲哚類和鞘脂類等信號(hào)分子類代謝物，這表明宜昌橙可能擁有更為復(fù)雜和緊密的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)調(diào)控代謝變化來(lái)響應(yīng)低溫脅迫。結(jié)合代謝組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析，研究揭示了脂質(zhì)代謝和苯丙烷代謝途徑中基因的表達(dá)量和代謝物含量與柑橘的抗寒性密切相關(guān)。深入分析顯示，在低溫處理下，宜昌橙中的鞘氨醇和綠原酸兩種代謝物大量積累。通過(guò)病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)，研究者沉默了宜昌橙中的CiSPT（參與鞘氨醇合成的基因）和CiHCT2（參與綠原酸合成的基因），導(dǎo)致這兩種代謝物的內(nèi)源含量顯著下降，植株的抗寒能力也隨之減弱。然而，當(dāng)外源添加鞘氨醇和綠原酸時(shí)，可以顯著恢復(fù)經(jīng)過(guò)基因沉默處理的宜昌橙植株的低溫敏感表型。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CiSPT和CiHCT2在調(diào)控鞘氨醇和綠原酸積累以及增強(qiáng)植株抗寒性中的關(guān)鍵作用。