LWT | 浙江大學(xué)王岳飛團(tuán)隊(duì)最新研究揭示伏磚茶風(fēng)味動(dòng)態(tài)變化過(guò)程

茯磚茶是一種具有豐富歷史遺產(chǎn)的重要類型的黑茶，由于其獨(dú)特的風(fēng)味特征和眾多的健康益處，最近引起了人們的重新關(guān)注。真菌發(fā)酵是茯磚茶生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟，在塑造其獨(dú)特品質(zhì)方面起著至關(guān)重要的作用。在這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程中，當(dāng)接種真菌和各種內(nèi)生菌在特定的高濕和適宜的溫度條件下茁壯成長(zhǎng)時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)和共生生命代謝活動(dòng)發(fā)生了動(dòng)態(tài)的相互作用。這種復(fù)雜的代謝干預(yù)導(dǎo)致茯磚茶原始成分發(fā)生深刻的生化變化，賦予茶一種精致而醇厚的香氣。目前對(duì)茯磚茶的研究主要集中在優(yōu)勢(shì)微生物、香氣以及微生物群對(duì)基本代謝物的影響上。然而，盡管有這些研究，在真菌發(fā)酵過(guò)程中，真菌與揮發(fā)性代謝物動(dòng)態(tài)進(jìn)化的關(guān)系、香氣轉(zhuǎn)化的分子基礎(chǔ)以及真菌合成香氣的具體途徑的研究仍然有限。

2024年6月4日，LWT-Food Science and Technology在線發(fā)表了浙江大學(xué)題為“Dynamical changes of volatile metabolites and identification of core fungi associated with aroma formation in Fu Brick tea during the fungal fermentation”的相關(guān)研究，研究利用ITS、揮發(fā)性代謝組以及電子鼻、電子舌等技術(shù)手段，旨在揭示伏磚茶在真菌發(fā)酵過(guò)程中真菌與揮發(fā)性物質(zhì)變化的相關(guān)關(guān)系。邁維代謝為本研究提供了GC-MS揮發(fā)性代謝組學(xué)的檢測(cè)和分析服務(wù)。

研究結(jié)果

1.電子鼻和電子舌分析：不同發(fā)酵時(shí)間具有不同的特征

首先利用電子鼻和電子舌捕捉茯磚茶的綜合香氣和風(fēng)味特征。根據(jù)采集的數(shù)據(jù)生成圖1所示的主坐標(biāo)分析(PCoA)。電子鼻結(jié)果表明，D0到D6和D9到FT（成品伏磚茶）的樣本之間存在明顯的分離，在不同真菌發(fā)酵時(shí)間之間無(wú)顯著交集。這強(qiáng)調(diào)了電子鼻分析在區(qū)分茯磚茶真菌發(fā)酵不同階段的香氣特征方面的功效。電子舌的PCoA結(jié)果進(jìn)一步表明樣品從D0和D3分離到D6。從雷達(dá)圖上可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酸味傳感器的響應(yīng)逐漸減弱，甜度傳感器的響應(yīng)逐漸增強(qiáng)。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間電子鼻和電子舌分析

2.ITS數(shù)據(jù)分析

不同真菌發(fā)酵階段的有效真菌序列總數(shù)如圖2A所示，與FT相比，D0的數(shù)量略低。根據(jù)序列片段的相似性進(jìn)一步分類，將7類茯磚茶樣品中的真菌序列以97%的相似性水平進(jìn)行大量過(guò)濾和聚類，得到234個(gè)OTU(圖2B)。值得注意的是，在所有7類樣品的整個(gè)真菌發(fā)酵過(guò)程中，12個(gè)OTUs始終存在。隨著真菌發(fā)酵時(shí)間的增加，OTU數(shù)量逐漸減少。有趣的是，在FT（成品伏磚茶）階段出現(xiàn)了四個(gè)額外的OTU，這種現(xiàn)象可能與干燥或儲(chǔ)存過(guò)程有關(guān)。

圖2 ITS數(shù)據(jù)分析

利用Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)進(jìn)一步估算了茯磚茶真菌的α多樣性。隨著真菌發(fā)酵時(shí)間的增加，真菌種類豐富度顯著下降。具體而言，在D3處真菌物種豐富度略有增加。FT的真菌種類豐富度高于D15。隨著真菌發(fā)酵的進(jìn)行，Shannon指數(shù)逐漸降低，意味著某些真菌獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，逐漸主導(dǎo)生態(tài)系統(tǒng)。在D9 ~ D15期間，Shannon指數(shù)略有上升，這可能是由于出現(xiàn)了第二優(yōu)勢(shì)真菌。結(jié)合Chao1指數(shù)，F(xiàn)T記錄的Shannon指數(shù)最低，說(shuō)明FT雖然真菌種類增加，但有一個(gè)特殊的優(yōu)勢(shì)種占優(yōu)勢(shì)。

圖3 真菌α多樣性分析

為了全面評(píng)估β多樣性并直觀地描述樣本距離關(guān)系，采用了Hcluster方法進(jìn)行可視化，分析發(fā)現(xiàn)了茯磚茶真菌發(fā)酵過(guò)程中的兩個(gè)不同階段:第1階段在D0，第2階段從D3到FT。經(jīng)過(guò)差異篩選，值得注意的是，所有樣品的初級(jí)門均為p_子囊菌門，占有效序列的57.11% ~ 99.90%。D0階段，p_擔(dān)子菌門成為次生優(yōu)勢(shì)門，占有效序列的32.41%。但從D3開始，這一比例有所下降，最終達(dá)到1.52%。在屬水平分析中，在D0期間鑒定出g_Wallemia、g_Penicillium和其他一些真菌，以耐鹽種為主。隨著真菌發(fā)酵的推進(jìn)，它們的貢獻(xiàn)逐漸減少。隸屬于p_子囊菌門的Eurotium從D3到FT占據(jù)優(yōu)勢(shì)，占有效序列的82.00% ~ 99.05%。在D6結(jié)束時(shí)，曲霉與Eurotium的競(jìng)爭(zhēng)停止，Eurotium在D9成為明顯的勝利者(g_曲霉屬真菌在D15期間略有增加，但在FT時(shí)再次下降)。關(guān)于在D9中出現(xiàn)亞優(yōu)勢(shì)菌株的猜測(cè)，物種注釋表明這種情況并未發(fā)生，Eurotium仍保持絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。剩余的菌株，雖然在D9中略有恢復(fù)，但在D12中逐漸減少到可以忽略不計(jì)的水平。

進(jìn)一步對(duì)真菌進(jìn)行了相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析，以辨別它們?cè)谡婢l(fā)酵過(guò)程中的促進(jìn)、拮抗和/或競(jìng)爭(zhēng)作用。其中，g_曲霉屬真菌和g_Eurotium的相對(duì)豐度最高，呈顯著負(fù)相關(guān)?？紤]到g_Eurotium在茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)地位，它與其他9個(gè)真菌屬始終保持負(fù)相關(guān)。此外，在與木質(zhì)素降解、土壤微生物、木材內(nèi)生菌和與樹木的共生關(guān)系等不同功能相關(guān)的幾個(gè)屬之間觀察到值得注意的正相關(guān)，這些都與真菌發(fā)酵有關(guān)。

圖4 β多樣性分析

3.揮發(fā)性代謝組檢測(cè)和分析

揮發(fā)性物質(zhì)的含量對(duì)茶葉香氣的影響至關(guān)重要。利用揮發(fā)性代謝組共鑒定到包括51種酯類、50種雜環(huán)化合物、48種萜類、30種醛類、22種芳烴和其他化合物（圖5B）。PCA分析表明在階段I (D0到D6)和階段II (D9到FT)之間觀察到明顯的分離（圖5A），與早期的電子鼻結(jié)果一致。其中105個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)在茯磚茶真菌發(fā)酵過(guò)程中直接產(chǎn)生風(fēng)味(rOAV>1)(圖5C)。揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量先增加后減少，從萜類化合物轉(zhuǎn)向雜環(huán)和硫化合物。值得注意的是1-p-menthene-8-thiol（KMW0466）一直主導(dǎo)著風(fēng)味譜。

在第1階段，風(fēng)味貢獻(xiàn)前5位分別是1-p-menthene-8-thiol（KMW0466）、β-離子酮（WMW0051*150）、5-乙  基-3-羥基-4-甲基-2 (5H)-呋喃酮（KMW0383）、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪（KMW0286）和反式-β-離子酮（KMW0583*150）。在第二階段，前11名的貢獻(xiàn)保持一致，KMW0466、KMW0286、WMW0051*150、KMW0383和D94(苯甲硫醇)構(gòu)成了主要的5種風(fēng)味物質(zhì)。不同的vm具有不同的香氣特征，表明從D9開始從甜美的花香和水果香味過(guò)渡到更復(fù)雜的堅(jiān)果和黃瓜香味。

圖5 揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)和分析

采用嚴(yán)格的篩選條件(VIP>1.0,p < 0.05)對(duì)一期和二期揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，22個(gè)DVMs上調(diào)(圖6A)，13個(gè)DVMs下調(diào)(圖6B)。值得注意的是，上調(diào)的化合物主要是醛類、酮類和萜類，而下調(diào)的化合物主要是萜類。這些轉(zhuǎn)變促進(jìn)了茯磚茶的轉(zhuǎn)型香氣從木質(zhì)、蠟質(zhì)和玫瑰色到更明顯的綠色、黃瓜味和脂肪味(圖6C)。此外，茯磚茶中的某些酮類和醛類，超過(guò)了其他黑茶中的酮類和醛類，顯著影響了其獨(dú)特的風(fēng)味。值得注意的是，KMW0421(水楊酸甲酯)和KMW0379(2-戊基吡啶)是變化最大的DVM，是茯磚茶獨(dú)特風(fēng)味的關(guān)鍵貢獻(xiàn)者。

圖6 風(fēng)味組學(xué)分析

4.ITS與揮發(fā)性代謝組聯(lián)合分析

利用Spearman相關(guān)分析，構(gòu)建了茯磚茶前6個(gè)真菌屬與DVMs的結(jié)合網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明g_Canadida與任何上調(diào)的DVMs之間沒有相關(guān)性。相反，除(E, E)-3,5- octadien -2-one（XMW0186.139 ）外，其他上調(diào)的DVMs與g_Eurotium呈正相關(guān)，與g_Aspergillus呈負(fù)相關(guān)。同樣，所有下調(diào)的DVMs與g_Eurotium呈負(fù)相關(guān)，與g_Wallemia呈正相關(guān)。除1-Nonanol（KMW0344 ）外，g_Aspergillus與其他下調(diào)產(chǎn)物呈正相關(guān)。此外，DVMs與g_Canadida和g_Penicillium的相關(guān)性也與g_Wallemia的相關(guān)性相似。綜上所述，這三個(gè)屬的相對(duì)豐度呈正相關(guān)，進(jìn)一步確定g_Penicillium的相對(duì)豐度與g_Aspergillus呈正相關(guān)（圖7）。

圖7 真菌與揮發(fā)性代謝物相關(guān)性分析

考慮到微生物活動(dòng)，尤其是外源酶的分泌對(duì)黑茶中芳香物質(zhì)轉(zhuǎn)化的重大影響，進(jìn)一步用picrust2數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)真菌進(jìn)行注釋，以推斷酶的功能（圖8）。該預(yù)測(cè)分析確定了9種酶——腺苷-三磷酸酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖糖苷酶、羧酯酶、過(guò)氧化氫酶、幾丁質(zhì)酶、外顯α-唾液酸酶和蛋白酪氨酸-磷酸酶——在整個(gè)真菌發(fā)酵過(guò)程中積極參與?？紤]到D9后伏磚茶固化后的香氣變化，推測(cè)香氣產(chǎn)生的主要驅(qū)動(dòng)因素與外顯α-唾液酸酶活性密切相關(guān)。

圖8 典型酶活性分析

為了揭示DVMs發(fā)生的潛在差異，對(duì)茯磚茶在真菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了KEGG功能注釋，共富集到5條和9條途徑。在前者的路徑包含在后者中。分類結(jié)果顯示，真菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)主要通過(guò)多種途徑進(jìn)行合成，包括氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、萜類和聚酮代謝、外源降解和代謝。進(jìn)一步研究各階段顯著上調(diào)和下調(diào)的物質(zhì)(D0、D3、D6、D9、D12、D15、FT)，確定苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、萜類骨架生物合成和α-亞麻酸代謝是關(guān)鍵物質(zhì)形成的重要途徑(圖9)。值得注意的是，如上所述，真菌和揮發(fā)性物質(zhì)的進(jìn)化在D9后趨于穩(wěn)定，D12后物質(zhì)沒有發(fā)生顯著變化。因此，該圖可以作為KEGG通路直至D12的總結(jié)。

圖9 伏磚茶風(fēng)味形成過(guò)程中的重要通路

研究總結(jié)

本研究對(duì)伏磚茶真菌發(fā)酵過(guò)程中獲得的7組工藝樣品進(jìn)行了系統(tǒng)的比較研究。除了利用電子感覺系統(tǒng)對(duì)伏磚茶進(jìn)行基本評(píng)估外，研究還深入研究了真菌群落演替和揮發(fā)性物質(zhì)在這一復(fù)雜過(guò)程中的變化動(dòng)態(tài)。ITS結(jié)果表明，g_Eurotium在D3后成為優(yōu)勢(shì)菌。同時(shí)，GC-MS結(jié)果揭示了真菌發(fā)酵過(guò)程中伏磚茶揮發(fā)性譜的實(shí)質(zhì)性變化，近35%的揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)歷了顯著的變化。在rOAV>1的105個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)中，對(duì)伏磚茶的關(guān)鍵香氣貢獻(xiàn)因子包括1-對(duì)甲烷-8-硫醇、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪、β-紫羅蘭酮和5-乙 基-3-羥基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮。這些化合物在整個(gè)真菌發(fā)酵過(guò)程中始終占大多數(shù)，有助于注入綠色，甜味，花香和水果香氣。