New Phytol | 新突破！轉錄組+代謝組揭示機械脅迫調控油菜胚胎發(fā)育及成熟機制

文章導讀：

胚在種子內最初的自由擴張在某種程度上被與它接觸的種皮所抑制，導致其形成褶皺和邊界。但機械力似乎觸發(fā)并加速了種子的成熟。然而，這種效應的機制基礎仍不清楚。近日，德國萊布尼茨植物遺傳與作物植物研究所Ljudmilla Borisjuk課題組在New Phytologist上發(fā)表題為“Mechanical forces orchestrate the metabolism of the developing oilseed rape embryo”的研究論文。研究者油菜體內體外空間限制后，進行磁共振成像和計算機圖形重建、免疫標記、流式細胞術、轉錄組學、蛋白質組學、脂質組學和代謝組學分析，揭示了機械力如何調控油菜胚胎發(fā)育并啟動其成熟過程的證據(jù)。

研究結果

1 空間限制影響胚胎發(fā)生過程

發(fā)育10天的莢果上纏繞管子阻礙種子發(fā)育的擴張空間（圖1a，b）。研究發(fā)現(xiàn)，處理過的莢果中形成的胚胎比對照胚胎更早開始變形，并且變形進展更快（圖1c）。處理組莢果中發(fā)育的胚胎完全占據(jù)了可用空間時，非處理組莢果種子子葉仍在擴張。表明胚乳對空間限制的響應比胚胎早得多（圖1e），并且胚乳在空間受限的種子中更早停止擴張。總體結論是，減少胚胎擴張的空間會誘導其過早變形。

圖1空間限制對甘藍型油菜胚胎發(fā)生的影響

2.空間限制減少了胚胎中的細胞增殖

流式細胞術測定了機械壓力后15、20和25天種子胚的細胞數(shù)量。15-25的時間跨度從細胞快速增殖期結束一直延伸到細胞擴增期。在機械壓力15天時，處理胚胎和對照胚胎的細胞數(shù)量相似(圖2a)，到20天時，處理組細胞數(shù)量增加了一倍，對照組細胞數(shù)量增加了兩倍(圖2b)。這表明，限制胚胎的生長會損害細胞的增殖。

圖2 空間限制條件下甘藍型油菜胚細胞增殖、基因表達及ABA含量

3.空間限制胚胎的轉錄組及代謝組分析

對機械壓力處理10和15天的處理組及對照組進行轉錄組檢測。10天兩組樣本差異基因僅有3個，15天后增加至76個。GO富集分析顯示，機械限制導致處理組“細胞對缺氧的響應”下調，而“硫酸鹽同化”上調。受壓胚胎中與壓力相關的蛋白和細胞增殖相關的基因表達下調，而與硫代葡萄糖苷合成相關的基因表達上調。機械壓力增加了胚胎對硫的需求，這與儲存蛋白和硫代葡萄糖苷的合成有關。受壓胚胎中與細胞周期控制、氧化應激防御和ABA（脫落酸）信號傳導相關的基因表達上調。通過LC-MS分析發(fā)現(xiàn)，受壓胚胎中的ABA水平更高，與此一致的是，與ABA信號傳導相關的轉錄因子的表達也上調。盡管施加了機械壓力，但某些已知的機械感知相關基因的轉錄沒有受到影響。數(shù)據(jù)表明對胚胎施加機械約束的效果是抑制細胞周期活性，同時促進儲存產(chǎn)物的合成/積累、ROS防御機制和ABA相關信號傳導。

對壓力處理5、10、15、20、25和30樣本進行靶向和非靶代謝組檢測，檢出152種代謝物。處理影響了糖酵解途徑（圖3）。處理組15/20d胚胎中，果糖-1,6-二磷酸及其兩個裂解產(chǎn)物二羥丙酮磷酸和甘油醛-3-磷酸的水平都顯著更高。處理組15d后，三酰甘油（TAG）合成前體甘油-3-磷酸（G3P）表達水平提高了九倍。機械限制15d后的胚胎進行脂質組檢測，鑒定出170種脂質。壓力脅迫處理TAG含量比未受壓胚胎高17-38%。油酸（C18:1）和二十碳烯酸（C20:1）的含量增加，同時高飽和脂肪酸的比例降低?？臻g限制促進了儲存脂質的沉積開始，但對其他脂質類別沒有影響。

圖3 空間限制條件下甘藍型油菜胚胎體內生長的代謝組變化

4.空間限制胚胎的蛋白質組檢測

對機械限制處理10，15天的種子分別進行蛋白質組檢測。10d，處理組與對照組有61種蛋白存在差異；15d時，有25種差異。空間限制處理促進了蛋白質儲存沉積，特別是某些特定蛋白質（如RmlC-like cupins、種子儲存白蛋白4和十字花蛋白1）的含量顯著增加。處理還影響了參與氨基酸合成、脂質合成/儲存、糖類代謝、ROS代謝和糖酵解的酶的蛋白質含量。胚胎特異性、與質膜相關的TRAF樣家族蛋白的積累受到抑制。一些差異積累的蛋白質也在珠被或胚乳中表達，它們的差異豐度可能與機械壓力誘導的珠被和/或胚乳生長過早停止有關。

圖4 空間限制甘藍型油菜種子蛋白質組的變化

5.空間限制對體外培養(yǎng)胚胎生長的影響

在子葉階段切除胚胎，并在不同體積特制球形培養(yǎng)室內培養(yǎng)，來研究種子對空間限制的響應?？臻g限制可以增加胚胎生物量和合成主要儲存產(chǎn)物的能力。生長空間越小，胚胎就越小，其脂質和蛋白質含量就越高。在空間制條件下生長的胚胎比未受阻礙生長的胚胎更早且更多地積累脂質

圖5 空間限制對甘藍型油菜胚離體培養(yǎng)生長成熟的影響

6.空間限制體外培養(yǎng)胚胎轉錄組及代謝組分析

對3.5mm和5mm限制空間的培養(yǎng)室培養(yǎng)的胚胎進行轉錄組測序。研究結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，3.5mm有316個差異基因，5mm有446個。兩組差異表達的基因中有178個基因是共同的，這表明空間限制對胚胎基因表達有顯著影響。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，在機械限制下，光合作用顯著下調。與細胞增殖、細胞板形成、胚胎極性和模式建立相關的基因的下調，以及與細胞分裂和分化調節(jié)相關的基因的下調，如BAM1和SERK1。流式細胞儀測量結果表明，機械應力的嚴重程度與胚胎細胞數(shù)量呈負相關，即空間限制導致細胞數(shù)量減少。與儲存化合物代謝促進相關的基因表達上調，如編碼寡肽轉運體、谷氨酸脫氫酶、谷胱甘肽S-轉移酶和LEA蛋白的基因。淀粉合成的發(fā)育關閉，表現(xiàn)為顆粒結合淀粉合成酶基因表達的下降。熱休克蛋白（HSPs）基因的上調表明胚胎早熟，這是晚期種子成熟的標志。與水分調節(jié)相關的基因，如編碼水通道活性相關蛋白的PIP3A和PIP3C，以及TPS1（海藻糖-6-磷酸合成酶）基因的表達被抑制，這與成熟種子的脫水特征一致

?？臻g限制處理的代謝組檢測發(fā)現(xiàn)，空間限制促進了能量豐富的核苷酸三磷酸和輔因子的積累，如維生素B6磷酸鹽、黃素單核苷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和有機酸（三羧酸循環(huán)的中間體）?？臻g限制導致短鏈脂肪酸、谷胱甘肽及其前體以及某些酚酸（包括苯甲酸，作為葉酸生物合成的前體）的積累，這些物質與多種細胞功能相關?？臻g限制的胚胎中，兩個糖酵解中間體果糖-1,6-二磷酸和二羥丙酮磷酸的水平得到提升，表明糖酵解途徑受到影響?？臻g限制幾乎耗盡了所有游離氨基酸（除了天冬酰胺）和多胺（如瓜氨酸）、三甲胺、乳酸和抗壞血酸，這些都是細胞代謝的關鍵成分?？臻g限制導致乙烯前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸的水平顯著升高。總體上，逐漸增加的機械限制在碳/氮（C/N）代謝上引起了特定變化，尤其是在核苷酸、輔因子和氧化還原代謝方面。這些發(fā)現(xiàn)表明，空間限制對胚胎的代謝途徑有顯著影響，特別是在能量代謝和儲存化合物的合成上。

圖6 代謝途徑圖顯示了體外培養(yǎng)的甘藍型油菜胚胎代謝產(chǎn)物豐度的變化

研究結論

本文對影響油菜胚胎體內或體外生長的機械約束的操作與分析方法相結合，包括磁共振成像和計算機圖形重建、免疫標記、流式細胞術、轉錄組學、蛋白質組學、脂質組學和代謝組學分析。數(shù)據(jù)表明，在體內，施加機械約束阻礙了種皮和胚乳的擴張，導致胚胎變形。胚胎發(fā)育的加速意味著細胞增殖的停止和脂肪和蛋白質儲存的刺激，這是胚胎成熟的特征。潛在的分子特征包括細胞周期控制、活性氧代謝和轉錄重編程，以及糖酵解通量的變構控制。縮小體外生長的胚胎的生長空間也引起了類似的反應。結論是，對發(fā)育中的油菜胚胎的生長施加機械約束是其成熟的重要觸發(fā)因素。