離心技術(shù)的應(yīng)用

離心技術(shù)的應(yīng)用

離心技術(shù)（centrifugal technique）是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運(yùn)動時受到一個外向的離心力的行為而發(fā)展起來的一種分離技術(shù)。這項技術(shù)應(yīng)用很廣，諸如分離出化學(xué)反應(yīng)后的沉淀物，天然的生物大分子、無機(jī)物、有機(jī)物，在生物化學(xué)以及其它的生物學(xué)領(lǐng)域常用來收集細(xì)胞、細(xì)胞器及生物大分子物質(zhì)。

　　一、基本原理的分類

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　?、彪x心力（centrifugal force，F(xiàn)c）離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運(yùn)動的任何物體都受到一個向外的離心力進(jìn)行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω²X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：

　　其中ω是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；X是顆粒離開旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。

　?、蚕鄬﹄x心力（relative centrifugal force，RCF）由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻(xiàn)中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。

　　RCF就是實(shí)際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。

　　式中X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec²）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。

　　在上式的基礎(chǔ)上，Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對應(yīng)的離心力的轉(zhuǎn)換列線圖，見圖16-4，在用圖16-4將離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)換成相對離心力時，先在離心機(jī)半徑標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，在圖中間RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)，即為相應(yīng)的離心力數(shù)值。例已知離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機(jī)的半徑為7.7cm，將兩點(diǎn)連接起來交于RCF標(biāo)尺，此交點(diǎn)500×g即是RCF值。

　?、吵两迪禂?shù)（sedimentation coefficient，s）根據(jù)1924年Svedberg對沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。

　　若ω用2πn/60表示，則

　　式中X₁為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X₂為離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。S實(shí)際上時常在10^-13秒左右，故把沉降系數(shù)10^-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，量綱為秒。

　?、闯两邓俣龋╯edimentation velocity）沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動的距離。

　　式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；η為流體介質(zhì)的粘度；ρ_P為粒子的密度；ρ_m為介質(zhì)的密度。

　　從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項沉降系數(shù)公式中，則S的表示式也可表示為：

　　從該式中可看出，①當(dāng)ρ_P＞ρ_m，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當(dāng)ρ_P＝ρ_m，則S＝0，粒子到達(dá)某一位置后達(dá)到平衡。③當(dāng)ρ_P＜ρ_m，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。

　?、党两禃r間（sedimentation time，Ts）在實(shí)際工作中，常常遇到要求在已有的離心機(jī)上把某一種溶質(zhì)從溶液中全部沉降分離出來的問題，這就必須首先知道用多大轉(zhuǎn)速與多長時間可達(dá)到目的。如果轉(zhuǎn)速已知，則需解決沉降時間來確定分離某粒子所需的時間。

　　根據(jù)沉降系數(shù)（S）式可得：

圖16-4　離心力的轉(zhuǎn)換列線圖

　　將左側(cè)r點(diǎn)與右側(cè)n點(diǎn)連成一條直線，與中間RCF相交的

　　點(diǎn)即為相對離心力(×g)RCF=1.118×10²×r×n²。

　　積分得

　　式中X₂為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離；X₁為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離，那么樣品粒子完全沉降到底管內(nèi)壁的時間（t₂－t₁）用Ts表示則式可改為：

　　式中Ts以小時為單位，S以Svedberg為單位。

　　⒍K系數(shù)（k factor） K系數(shù)是用來描述在一個轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來的效率。也就是溶液恢復(fù)成澄清程度的一個指數(shù)，所以也叫“cleaning factor”。原則上，K系數(shù)愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。

　　其中R_max為轉(zhuǎn)子最大半徑；R_min為轉(zhuǎn)子最小半徑。由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系數(shù)是一個變數(shù)。當(dāng)轉(zhuǎn)速廢，或者離心管的溶液量不同，即粒子沉降的路徑改變時，K系數(shù)就改變了。通常，離心機(jī)的轉(zhuǎn)子說明書中提供的K系數(shù)，都是根據(jù)最大路徑及在最大轉(zhuǎn)速下所計算出來的數(shù)值。如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysome，采用的轉(zhuǎn)子的K系數(shù)是323，那么預(yù)計沉降到管底所需的離心時間是T＝k/S＝4h，利用此公式預(yù)估的離心時間，對水平式轉(zhuǎn)子最適合；對固定角式轉(zhuǎn)子而言，實(shí)際時間將比預(yù)估的時間來得快些。

　　（二）分類

　　根據(jù)離心原理，按照實(shí)際工作的需要，目前已設(shè)計出許多離心方法，綜合起來大致可分三類。

　　⒈平衡離心法根據(jù)粒子大小、形狀不同進(jìn)行分離，包括差速離心法（differential velocity centrifugation）和速率區(qū)帶離心法（rate zonal centrifugation）。

　?、驳让芏入x心法（jsopycnic centrifugation）又稱等比重離心法，依粒子密度差進(jìn)行分離，等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱為密度梯度離心法。

　?、辰?jīng)典式沉降平衡離心法用于對生物大分子分子量的測定、純度估計、構(gòu)象變化等。

　　二、離心分離方法

　　（一）差速離心法

　　它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級分離出所需要的物質(zhì)。

　　差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。

　　例如用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份

　　（二）速率區(qū)帶離心法

　　速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂