激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用

　　摘 要 激光掃描共聚焦顯微鏡是近十年發(fā)展起來的醫(yī)學(xué)圖象分析儀器，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于熒光定量測量、共焦圖象分析、三維圖象重建、活細(xì)胞動力學(xué)參數(shù)監(jiān)測和胞間通訊研究等方面。其性能為普遍光學(xué)顯微鏡質(zhì)的飛躍，是電子顯微鏡的一個補(bǔ)充。本文以美國Meridian公司的ACAS ULTIMA312為例簡要介紹了激光掃描共聚顯微鏡系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，功能和生物學(xué)應(yīng)用前景。

　　關(guān)鍵詞 激光；共聚焦顯微鏡；粘附細(xì)胞分析與篩選（ACAS）

　　激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser scanning Confocal Microscopy ，簡稱LSCM）是近代生物醫(yī)學(xué)圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，利用計算機(jī)進(jìn)行圖象處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化。已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、解剖學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域[1、2、3]，對生物樣品進(jìn)行定性、定量、定時和定位研究具有很大的優(yōu)越性，為這些領(lǐng)域新一代強(qiáng)有力的研究工具。

　　創(chuàng)建于1983年的美國Meridian公司，在90年代推出的“激光掃描共聚焦顯微鏡”這一項(xiàng)具有劃時代的義意的高科技產(chǎn)品，曾獲得美國“政府新產(chǎn)品獎”和兩次“高科技領(lǐng)先技術(shù)獎”，它能達(dá)到每秒120幅畫面的高速掃描激光共聚焦觀察，可提供實(shí)時，真彩色的激光共聚焦原色圖象。我院最近引起的ACAS uLTIMA312是Meridian公司最新的高科技產(chǎn)品，為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器?，F(xiàn)以該儀器為例介紹激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用。

　　1、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成

　　有關(guān)共聚焦顯微鏡的某些技術(shù)原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡[5]，1985年Wijnaendts Van Resandt發(fā)表了第一篇有關(guān)激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學(xué)中應(yīng)用的文章，到了1987年，才發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。

　　激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理如圖1所示，激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過擴(kuò)束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色反射鏡使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過物鏡會聚在物鏡的焦點(diǎn)上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各個方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過物鏡、長通分色反射鏡、聚焦透鏡、會聚在聚焦物鏡的焦點(diǎn)處，再通過焦點(diǎn)處的針孔，由檢測器接收。

　　從圖1中可以看出，只有在物鏡的焦平面上發(fā)出的熒光才夠到達(dá)檢測器，其它位置發(fā)出的光均不能過針孔。由于物鏡和會聚透鏡的焦點(diǎn)在同一光軸上，因而稱這種方式成像的顯微鏡為共聚焦顯微鏡為共聚顯微鏡。在成像過程中針孔起著關(guān)鍵作用，針孔直徑的大小不僅決定是以共聚焦掃描方式成像還是以普遍學(xué)顯微鏡掃描方式成像，而且對圖像的對比度和分辨率有重要的影響。

　　ACAS ULTIMa 312采用快速鏡掃描或臺階掃描對樣品逐點(diǎn)掃描成像，由于樣品中不同的掃描點(diǎn)始終在物鏡和會聚透鏡的光軸上，因而它以相同的信噪比掃描整個樣品，掃描精度達(dá)0.1μm，掃描面積最大的為10cm×8cm，當(dāng)激光逐點(diǎn)掃描樣品時，針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，并將之轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號傳輸至計算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚聚焦圖像。一個微動步進(jìn)馬達(dá)控制栽物臺的升降，使焦平面依次位于標(biāo)本的不同層面上，可以逐層獲得標(biāo)本相應(yīng)的光學(xué)橫斷面的圖像。這稱為“光學(xué)切片”。再利用計算機(jī)的圖像處理及三維重建軟件。可以得到高清晰度來表現(xiàn)標(biāo)本的外形剖面，十分靈活、直觀地進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

　　2、激光掃描共聚焦顯微鏡硬件和軟件系統(tǒng)

　　2.1 ACAS ULTIMa 312硬件及參數(shù)指標(biāo)　　激光光源：氬離子激光（50mW的紫外光、999 mW的可見光），能同時/順序/分別輸出紫外光和可見光，激發(fā)波長為351-364nm；488nm；514nm?！　∮嬎銠C(jī)系統(tǒng)：80586/133MHz PCI/80MB RAM/2000MB SCSI硬盤/150MB Bernoulli盤驅(qū)動器/17’’大屏幕顯示器。　　共聚焦系統(tǒng)：計算機(jī)自動控制光路準(zhǔn)調(diào)節(jié)；計算機(jī)控制孔徑校準(zhǔn)；計算機(jī)調(diào)節(jié)孔徑大?。蛔詣覼軸調(diào)節(jié)（最小0.1μm）。　　光學(xué)探測系統(tǒng)：3個測窗式PMT采集熒光；1個CCD系統(tǒng)；12位的高速A/D轉(zhuǎn)換器?！　D像分辨率：圖像大小1535×1535；像素最小距離：0.1μm；灰度為4096級?！　呙璺绞剑嚎焖夔R掃描Dual Scan臺階掃描；掃描精度0.1μm；掃描面積最大為10cm×8cm ；掃描平面：XY和XZ和獨(dú)特點(diǎn)、線、面掃描。2.2激光掃描共聚焦顯微鏡軟件系統(tǒng)

　　ACAS ULTIMa 312系統(tǒng)采用獨(dú)特設(shè)計的軟件將激光細(xì)胞儀與先進(jìn)的計算機(jī)技術(shù)結(jié)合，產(chǎn)生快速、高效、靈活的操作系統(tǒng)，完備的數(shù)據(jù)采集、分析與管理功能。基于生物醫(yī)學(xué)研究有如下的軟件。

　　Image Analyze―對于單色、比色和三色標(biāo)記的二維熒光圖像的定量分析，可產(chǎn)生透射光圖像重疊，同時Auto Image可多個區(qū)域的自動掃描和熒光定量，以及相同區(qū)域的時間順序掃描?！　atio Analysis和 Kinetics―測定細(xì)胞內(nèi)的離子變化，可有點(diǎn)掃描、線掃描及圖像掃描三種測定形式，以監(jiān)測各種速率的生物反應(yīng)?！　ell ?CCell Communication and FRAP-相鄰細(xì)胞的FRAP分析。該軟件首先用可光淬滅特異的細(xì)胞熒光，然后在多個時間點(diǎn)掃描，此掃描可對單一區(qū)域或細(xì)胞的多個選擇區(qū)域，可產(chǎn)生透射光圖像并與其它圖像重疊?！　ell List―儲存被選擇細(xì)胞的位置，即可自動對較大樣品進(jìn)行掃描，又可產(chǎn)生較小樣品特異部位的網(wǎng)絡(luò)位置表，以進(jìn)行自動的測量、篩選和重復(fù)測定?！　ell Sorting―ACAS具備如下四種分選方式：　　Ablation Sort:預(yù)選定義一個熒光閾值 ，然后對特定細(xì)胞殺傷。②CookieCutter Sort在用戶定義的中心點(diǎn)四周切割Cookies。③Quick Sort：對已定義的細(xì)胞表列，用Ablation或Cookie Cutter作分選。④Manual Sort：直接使用鼠標(biāo)控制載物臺位置及激光脈沖，并殺滅和分選細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞顯微外科，染色體切割和光隱阱等操作?！　onfocal Imaging―共聚焦分析，可實(shí)現(xiàn)Z軸定量，三維立體圖像分析（包括SFP模擬熒光處理法，DP深度投影法和SP文體投影法），以及視點(diǎn)移動動畫。

　　3 激光掃描共聚焦顯微鏡在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用

　　3.1 定量熒光測量

　　ACAS可進(jìn)行重復(fù)性極佳的低光探測及活細(xì)胞熒光定量分析。利用這一功能既可對單個細(xì)胞或細(xì)胞群的溶酶體，線粒體、DNA、RNA和受體分子含量、成份及分布進(jìn)行定性及定量測定，還可測定諸如膜電位和配體結(jié)合等生化反應(yīng)程度。此外，還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測定，這種定量可以準(zhǔn)確監(jiān)測抗原表達(dá)，細(xì)胞結(jié)合和殺傷及定量的形態(tài)學(xué)特性，以揭示諸如腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的準(zhǔn)確定位及定量信息。

　　3.2 定量共聚焦圖像分析

　　借助于ACAS 激光共焦系統(tǒng)，可以獲得生物樣品高反差、高分辨率、高靈敏度的二維圖像。可得到完整活的或固定的細(xì)胞及組織的系列及光切片，從而得到各層面的信息，三維重建后可以揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。能測定細(xì)胞光學(xué)切片的物理、生物化學(xué)特性的變化，如DNA含量、RNA含量、分子擴(kuò)散、胞內(nèi)離子等，亦可以對這些動態(tài)變化進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量、定時及定位分析。

　　3.3 三維重組分析生物結(jié)構(gòu)

　　ACAS使用SFP進(jìn)行三維圖像重組，SFP將各光學(xué)切片的數(shù)據(jù)組合成一個真實(shí)的三維圖像，并可從任意角度觀察，也可以借助改變照明角度來突出其特征，產(chǎn)生更生動逼真的三維效果。

　　3.4 動態(tài)熒光測定

　　Ca2+ 、pH 及其它細(xì)胞內(nèi)離子測定，利用ACAS能迅速對樣品的點(diǎn)，線或二維圖像掃描，測量單次、多次單色、雙發(fā)射和三發(fā)射光比率，使用諸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多種熒光探針對各種離子作定量分析?？梢灾苯拥玫酱蠓肿拥臄U(kuò)散速率，能定量測定細(xì)胞溶液中Ca2+對腫瘤啟動因子、生長因子及各種激素等刺激的反應(yīng)，以及使用雙熒光探針Fluo-3和CNARF進(jìn)行Ca2+和pH的同時測定。

　　3.5 熒光光漂白恢復(fù)（FRAP）--活細(xì)胞的動力學(xué)參數(shù)

　　熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)借助高強(qiáng)度脈沖式激光照射細(xì)胞某一區(qū)域，從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅，該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子將以一定速率向受照區(qū)域擴(kuò)散，可通過低強(qiáng)度激光掃描探測此擴(kuò)散速率。通過ACAS可直接測量分子擴(kuò)散率、恢復(fù)速度，并由此而揭示細(xì)胞結(jié)構(gòu)及相關(guān)的機(jī)制。

　　3.6 胞間通訊研究

　　動物細(xì)胞中由縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊被認(rèn)為在細(xì)胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于測定相鄰植物和動物細(xì)胞之間細(xì)胞間通訊，測量由細(xì)胞縫隙連接介導(dǎo)的分子轉(zhuǎn)移，研究腫瘤啟動因子和生長因子對縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊的抑制作用，以及胞內(nèi)Ca2+ ,PH和cAMP水平對縫隙連接的調(diào)節(jié)作用。

　　3.7 細(xì)胞膜流動性測定

　　ACAS設(shè)計了專用的軟件用于對細(xì)胞膜流動性進(jìn)行定量和定性分析。熒光膜探針受到極化光線激發(fā)后，其發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn)，而這種有序的運(yùn)動自由度依賴于熒光分子周圍的膜流動性，因此極性測量間接反映細(xì)胞膜流動性。這種膜流動性測定在膜的磷脂酸組成分析、藥物效應(yīng)和作用位點(diǎn)，溫度反應(yīng)測定和物種比較等方面有重要作用。

　　3.8 籠鎖―解籠鎖測定

　　許多重要的生活物質(zhì)都有其籠鎖化合物，在處于籠鎖狀態(tài)時，其功能被封閉，而一旦被特異波長的瞬間光照射后，光活化解籠鎖，使其恢復(fù)原有活性和功能，在細(xì)胞的增值、分化等生物代謝過程中發(fā)揮功能。利用ACAS可以人為控制這種瞬間光的照射波長和時間，從而達(dá)到人為控制多種生物活性產(chǎn)物和其它化合物在生物代謝中發(fā)揮功能的時間和空間作用。

　　3.9 粘附細(xì)胞分選

　　ACAS是目前唯一能對粘附細(xì)胞進(jìn)行分離篩選的分析細(xì)胞學(xué)儀器，它對培養(yǎng)皿底的粘附細(xì)胞有兩種分選方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司專利技術(shù)，首先將細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在特制培養(yǎng)皿上，然后用高能量激光的欲選細(xì)胞四周切割成八角形幾何形狀，而非選擇細(xì)胞則因在八角形之外而被去除，該分選方式特別適用于選擇數(shù)量較少諸如突變細(xì)胞、轉(zhuǎn)移細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞，即使百萬分之一機(jī)率的也非常理想。（2）激光消除法，該方法亦基于細(xì)胞形態(tài)及熒光特性，用高能量激光自動殺滅不需要的細(xì)胞，留下完整活細(xì)胞亞群繼續(xù)培養(yǎng)，此方法特別適于對數(shù)量較多細(xì)胞的選擇。

　　3.10 細(xì)胞激光顯微外科及光陷阱技術(shù)

　　借助ACAS可將激光當(dāng)作“光子刀”使用，借此來完成諸如細(xì)胞膜瞬間穿孔、切除線粒體、溶酶體等細(xì)胞器、染色體切割、神經(jīng)元突起切除等一系列細(xì)胞外科手術(shù)。通過ACAS光陷阱操作來移動細(xì)胞的微小顆粒和結(jié)構(gòu)，該新技術(shù)廣泛用于染色體、細(xì)胞器及細(xì)胞骨架的移動。

　　4、結(jié)語

　　激光掃描共聚焦顯微鏡是近十年發(fā)展起來的醫(yī)學(xué)圖像分析儀器，與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三維清晰度的原色圖象。并可探測某些低對比度或弱熒光樣品，通過目鏡直接觀察各種生物樣品的弱自發(fā)熒光。能動態(tài)測量Ca2+ 、pH值，Na1+、Mg2+等影響細(xì)胞代謝的各種生理指標(biāo)[9]，對細(xì)胞動力學(xué)研究有著重要的意義。同時激光掃描共聚顯微鏡可以處理活的標(biāo)本，不會對標(biāo)本造成物理化學(xué)特性的破壞，更接近細(xì)胞生活狀態(tài)參數(shù)測定?？梢娂す鈷呙韫簿劢癸@微鏡是普遍顯微鏡上的質(zhì)的飛躍，是電子顯微鏡的一個補(bǔ)充，現(xiàn)已廣泛用于熒光定量測量，共焦圖像分析，三維圖像重建、活細(xì)胞動力學(xué)參數(shù)分析和胞間通訊研究等方面，在整個細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。