基于生物發(fā)光技術的細菌總數(shù)快速檢測儀

　　岳偉偉，周愛玉，何保山，羅金平，蔡新霞

　　(1．中國科學院電子學研究所 傳感技術國家重點實驗室，北京 100080；2．中國科學院研究生院，北京 100080)

　　1 引言

　　細菌總數(shù)檢測是食品衛(wèi)生學檢測領域的重要檢測指標，主要是用來判斷食品被污染的程度。對細菌總數(shù)進行快速準確的檢測一直是該領域內(nèi)重要的研究課題。對細菌總數(shù)進行檢測的國標方法是平板計數(shù)法，需要將樣品用營養(yǎng)瓊脂37℃培養(yǎng)48 h記數(shù)，測試時間長，操作繁瑣，不適合現(xiàn)場檢測。ATP生物發(fā)光檢測方法具有檢測速度快、成本低、易于操作等特點，已引起眾多研究者關注。同時，因為ATP生物發(fā)光技術以生物體內(nèi)的ATP作為檢測對象，不僅包括細菌，也包括體細胞在內(nèi)的食品殘渣等食品污染物，因此適合在食品衛(wèi)生檢測領域?qū)πl(wèi)生狀況進行快速檢測。

　　使用ATP生物發(fā)光技術測量ATP最早見于1949年Mcelroy的報道。自此以后，ATP生物發(fā)光技術引起廣泛關注。本文在分析前人工作的基礎上，設計了一種ATP生物發(fā)光檢測儀，選擇光電倍增管(H5773-02，日本，濱松光子)作為光電轉(zhuǎn)換器件，其峰值響應波長為500 nm，與反應所發(fā)熒光波長基本一致，從而提高檢測靈敏度。本檢測儀采用自動加樣技術，在加入被檢測樣品后，在反應腔內(nèi)由自動加樣裝置向檢測樣品池中自動加入反應試劑，從而既避免了外界光的干擾，也有效地提高了加樣精度，從而提高了儀表的檢測可靠性及準確性。利用本檢測儀對10-6～10-14mol／L標準ATP樣品進行了檢測，輸出信號與樣品濃度間的相關性達到0.986，可以滿足測量要求。

　　2 系統(tǒng)設計

　　2.1 檢測原理

　　ATP即三磷酸腺苷，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種能量物質(zhì)。實驗證明，在生理條件下，每個細菌細胞中所含ATP的含量大致相同，約為10-18mol／個。螢火蟲熒光素酶簡稱蟲光素酶，是一種能將化學能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿幕钚缘鞍踪|(zhì)，即生物催化劑。ATP在蟲光素酶的催化作用下，與熒光素在有氧環(huán)境及二價鎂離子作用下，反應釋放出熒光。當熒光素及蟲光素酶過量情況下，釋放的熒光與ATP在一定范圍內(nèi)成線性關系，因此可以通過測量熒光光強檢測樣品中的ATP，進而檢測其中的細菌總數(shù)。

　　2.2 結(jié)構(gòu)設計

　　本檢測儀的結(jié)構(gòu)如圖1所示，主要包括三部分，分別為自動進樣單元、光電轉(zhuǎn)換單元和信號采集處理及控制單元。其中，自動進樣單元包括三套蠕動泵(WX10，保定蘭格恒流泵有限公司)和試劑盒，分為獨立三路加樣通路，分別為體細胞裂解劑、細菌細胞裂解劑和熒光素一熒光素酶發(fā)光試劑。根據(jù)測試需要，蠕動泵在控制單元控制下，向光電轉(zhuǎn)換單元中的樣品池加入對應反應試劑。光電轉(zhuǎn)換單元包括檢測樣品池和光電轉(zhuǎn)換器件。為消除外界光的干擾，整個光電轉(zhuǎn)換單元被密封在暗盒中。光電轉(zhuǎn)換器件將反應釋放熒光轉(zhuǎn)化為電信號，由信號采集處理單元采集并處理，并對測試結(jié)果進行實時顯示和存儲。

　　2.3 電路設計

　　系統(tǒng)的電路結(jié)構(gòu)如圖2所示。光電轉(zhuǎn)換器件將熒光信號轉(zhuǎn)換為電流信號，通過微處理芯片ADuC834(Analog Devices，美國)對信號進行采集及處理。ADuC834同時作為控制核心，控制自動加樣單元，顯示及存儲單元，并可將測量結(jié)果通過RS232接口上傳至上位機以進行結(jié)果分析。

　　2.4 軟件設計

　　檢測儀表的操作軟件由C語言編寫，軟件結(jié)構(gòu)如圖3所示，共分三項功能模塊，分別為測量、記錄和儀表設置。其中，測量分為儀表獨立測量和連接電腦測量。儀表獨立測量時，微處理芯片ADuC834對一定時間內(nèi)的信號采集并進行積分處理，然后將測試結(jié)果實時顯示，根據(jù)用戶選擇也可將測試結(jié)果上傳至計算機；聯(lián)機測量時，ADuC834對所采集的信號不進行處理，而是直接將其傳送到上位計算機中，并實時顯示時間響應曲線，方便用戶在計算機對所測數(shù)據(jù)進行分析，適合于實驗室中的測試分析。記錄子菜單分為記錄查詢和記錄刪除，用以對記錄進行操作。采用24LC256作為外部數(shù)據(jù)存儲芯片，本儀表設計可存儲測試結(jié)果200條，記錄查詢時可對逐條記錄進行顯示；記錄刪除則分為逐條刪除和全部刪除；設置子菜單可實現(xiàn)儀表校準和倍增管電壓調(diào)整兩項功能。

　　3 實驗與結(jié)果

　　3.1 器件選取

　　由于ATP生物發(fā)光所發(fā)光強較弱，因此本檢測儀選用高靈敏的光電倍增管作為光電轉(zhuǎn)換器件。利用F-4500熒光分光光度計(日本，日立)對ATP生物發(fā)光反應所發(fā)熒光波長進行掃描，峰值波長約為550 nm。為保證檢測具有更高靈敏度，所選光電倍增管的響應波長應與熒光波長一致。日本濱松光子的H5773-02型光電倍增管的響應波長為330～850 nm，峰值檢測波長在500～600 nm基本保持恒定，因此符合本系統(tǒng)設計要求。

　　3.2 結(jié)果與討論

　　實驗選擇標準ATP樣品作為檢測對象，濃度范圍為10-6～10-14mol／L，實驗中所用熒光素及熒光素酶購自美國普洛麥格公司。實驗采用聯(lián)機測量方式，將本檢測儀與計算機通過。RS232接口相連接，儀表信號采集單元采集熒光信號后直接上傳至計算機并將測試結(jié)果實時顯示。測量結(jié)果如圖4所示。

　　在反應中，加入發(fā)光反應試劑時，體系中樣品濃度相對較高，因此在短時間內(nèi)即迅速反應釋放大量熒光，此時熒光光強較強，因此測量結(jié)果可能會超出系統(tǒng)的測試量程。由于本儀表的最大輸出電壓為2500 mV，反應初期釋放的熒光可能會超出該范圍，在圖中表現(xiàn)為前端的水平直線。隨著反應進行，體系中樣品和試劑的濃度逐漸降低，所釋放熒光隨之逐漸衰減。由圖可見，不同樣品濃度的ATP隨反應進行，進入測量量程的時間不同，濃度越高，衰減越慢，進入測量量程的時間越長，反之越短。對圖4中各響應曲線400 s內(nèi)的測量值進行積分，作為各濃度樣品的輸出信號。輸出信號與濃度的關系如圖5所示。由圖可以看出，輸出信號隨濃度增加而增加，且有明顯梯度，兩者的線性相關系數(shù)達到0.986。這一結(jié)果說明本檢測系統(tǒng)可以對ATP濃度進行快速檢測。由于細菌細胞中所含ATP含量基本一致，因此，本檢測儀可實現(xiàn)對細菌總數(shù)的現(xiàn)場快速檢測。

　　4 結(jié) 論

　　本文針對細菌總數(shù)檢測需求，設計了一種基于ATP生物發(fā)光技術的細菌總數(shù)快速檢測儀。該檢測儀在對現(xiàn)有產(chǎn)品進行分析的基礎上，選擇H5773-02光電倍增管作為光電轉(zhuǎn)換器件，其檢測波長與生物發(fā)光反應所釋放熒光波長一致，可有效提高檢測靈敏度。采用自動加樣技術，在暗室內(nèi)加入發(fā)光反應試劑，消除了外界光的干擾，且獲得了反應最初的信號。本文以細菌檢測的中間產(chǎn)物標準ATP溶液作為檢測對象，對所設計的檢測儀進行測試。將檢測儀與計算機連接測量，獲得了各反應所釋放熒光強度的時間響應曲線。在此基礎上，對響應曲線400 s內(nèi)的值進行積分，作為對應樣品濃度的輸出信號，得到了輸出電壓與濃度的關系曲線，兩者的線性相關系數(shù)達到0.986，可滿足測試要求。本文所設計的針對細菌總數(shù)的檢測儀具有檢測速度快、自動化程度高、操作簡單、小型便攜等特點，在口岸、衛(wèi)生監(jiān)管部門、食品生產(chǎn)部門等對產(chǎn)品、環(huán)境等的衛(wèi)生狀況進行現(xiàn)場快速檢測領域具有很好的應用前景。