如何確定光譜信號就是所標(biāo)記探針的信號

　　1.自發(fā)熒光的可變性。a在不同激發(fā)光條件下，自發(fā)熒光會有明顯不同；b動物身體的不同部位會有不同的自發(fā)熒光；c同一只動物在不同時間自發(fā)熒光的波譜和強度也可以不同；d不同小鼠的自發(fā)熒光在波譜和強度上也有差別；e有時會受到飼料的影響。

　　2.所用探針的發(fā)射波長較長。用于基因和細(xì)胞水平熒光探針或熒光蛋白發(fā)射波長通常在600nm以下，而活體研究最佳的發(fā)射波長范圍在600-900nm之間。

　　3.受探針濃度的影響。熒光探針通常通過尾靜脈打入體內(nèi)，探針會被動物的血液和組織稀釋，如果沒有明顯的靶向，在活體內(nèi)信號會比較弱，因此探針的靶向性一定要明確，如果沒有靶向性，在活體條件下尋找探針的特征光譜會非常難。

　　4.受位置的影響。如果探針靶向的部位距體表較遠(yuǎn)，一方面激發(fā)光的射入會減少，同時發(fā)射光也會被組織吸收，位置越深，減少越多。因此如果靶向的部位較深，一定要保證探針的濃度使發(fā)光足夠強，同時盡量選用發(fā)射波長較長的探針。

　　5.合成的探針在活體條件下容易發(fā)生變化。用化學(xué)或生物的方法合成探針通常在較純的溶劑中發(fā)生反應(yīng)，但是活體條件下，動物的血液、組織液成分復(fù)雜，親水或疏水性質(zhì)難以預(yù)測，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)大量存在，在體外表現(xiàn)很好的探針也有可能在體內(nèi)發(fā)生復(fù)雜的變化，導(dǎo)致探針發(fā)生結(jié)構(gòu)改變或脫落，從而發(fā)射波譜也會發(fā)生未知的改變。

　　活體熒光成像面臨著多方面的挑戰(zhàn)，如何才能做到準(zhǔn)確無誤的尋找到所要的波譜，進而進行合適的光譜分離呢？以下是一些做體內(nèi)熒光成像的一些建議：

　　1.探針體外表現(xiàn)穩(wěn)定可靠。探針合成之后必須要在打入體內(nèi)之前進行成像，確定發(fā)射波譜和強度，需要考察不同批次探針之間是否存在差異，是否有淬滅現(xiàn)象，如果可能的話，用血液等生物體液溶解探針觀察是否存在變化。另外在體外觀察探針時，也一定要用溶劑做對照。

　　2.要確定靶向性。也就是說要有陽性對照，比如說要做腫瘤的早期診斷，盡量參考前人研究先用確定能夠靶向的分子作為陽性對照，這樣打入體內(nèi)后，確定能夠在腫瘤位置找到探針的波譜，如此確定之后，找到適合體內(nèi)光譜分離的拆分條件，用于之后的進一步實驗。

　　3.活體成像時一定要有對照。也就是說有陰性對照組，比如通過陽性對照組確定波譜之后，以此光譜分離的拆分條件對陰性對照組進行拆分，如果條件合適的話，陰性對照組應(yīng)該是沒有相應(yīng)信號的。如此，再比較拆分條件中探針的發(fā)射波長和體外觀察時的發(fā)射波長，如果兩者比較接近，那么就能夠肯定所尋找的探針波譜就是所考察的信號。

　　4.通過已有知識和時間變化來確定。如果已知所考察探針是親肝的或親腎的，在活體內(nèi)在肝或腎的部位出現(xiàn)信號的聚集，那么此處的信號可能會是所考察探針的信號，另外根據(jù)信號隨時間的變化來確定是不是所要的信號，比如腫瘤部位的某種信號在注射探針后有明顯的隨時間的上升后下降的過程，這種現(xiàn)象也提示這個信號就是所考察探針的信號。

　　5.實驗初期，盡量選用較高濃度或發(fā)光強度的探針。新合成的探針一般會首先觀察它的靶向性和體內(nèi)代謝情況，這時盡量選用最大的劑量或濃度，在動物生命體征不受影響的情況下，越多含量的探針對于體內(nèi)觀察越有利。在對考察探針體內(nèi)靶向及代謝情況比較了解之后再考慮減少含量，達(dá)到最優(yōu)的生物學(xué)效果。

　　通過以上建議，可以歸納為如下流程圖：