反相色譜條件下三唑類手性農藥對映異構體的拆分

　　采用自制的纖維素三手性固定相和直鏈淀粉三手性固定相，在反相色譜條件下成功地拆分了己唑醇、烯唑醇、烯效唑、粉唑醇、三唑酮和戊唑醇對映異構體。

　　兩種固定相都有很強的拆分能力。在優(yōu)化的色譜條件下，己唑醇和烯唑醇在這兩種固定相上都能被分離；三唑酮只能在CDMPCCSP上分離；粉唑醇、戊唑醇、烯效唑只能在ADMPCCSP上分離。流動相中水的含量增加會使對映體的保留增強，分離的可能性增大。在0～40℃研究溫度范圍內，容量因子k隨溫度的升高而減少，除烯效唑與戊唑醇外，其它手性農藥的選擇因子α也隨溫度的升高而減少，而分離度Rs隨溫度變化沒有明顯的規(guī)律，最好的分離度不都出現在低溫。對映體流出順序用圓二色檢測器測定。

　　1引言

　　近年來，隨著手性技術的發(fā)展，有關光學活性農藥的研究已成為農藥化學領域的熱門課題。在已商品化的農藥中，約有26%的農藥具有手性中心，其中大部分都是以外消旋體的形式出售和使用。將外消旋的手性農藥施加于生物體時，對映體之間的差異不僅表現在生物活性上，還表現在對生物體的毒性、體內的吸收、轉移、代謝以及消除等方面。因此建立高分離度、高靈敏度的手性農藥拆分和測定方法具有重要的意義。常用的手性分離方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、分子烙印和毛細管電泳法等，其中高效液相色譜手性固定相法是重要的一種。在眾多的手性固定相中，多糖（常用纖維素和淀粉）衍生物CSPs顯示出拆分能力強、適用范圍廣等優(yōu)點。己唑醇、烯唑醇、烯效唑、粉唑醇、三唑酮和戊唑醇等均屬于三唑類農藥，是一類重要的廣譜殺菌劑。有關其對映體的拆分方法主要有氣相色譜法、毛細管電泳法、手性流動相添加劑法、手性固定相法和多糖類手性固定相法等。而多糖類手性固定相高效液相色譜法主要在正相條件下對三唑類農藥進行拆分。本研究利用自制的纖維素三（3，5二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相（CDMPCCSP）和直鏈淀粉三（3，5二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相（ADMPCCSP），在反相色譜條件下，以甲醇/水或乙腈/水為流動相，在高效液相色譜儀上實現了己唑醇、烯唑醇、烯效唑、粉唑醇、三唑酮和戊唑醇對映體的拆分。比較了固定相、流動相、溫度對手性拆分的影響，同時利用圓二色檢測器測定了對映體的流出順序。

　　2實驗部分

　　2.1儀器與試劑1100型高效液相色譜儀（Agilent公司），配二極管陣列檢測器；JASCO2000高效液相色譜儀（日本JASCO公司），配圓二色檢測器；液相色譜裝柱機（北京福思源機械加工部）；AT930制冷、加熱兩用色譜柱溫箱（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。3，5二甲基苯基異氰酸酯（Merck公司）；直鏈淀粉球（Sigma公司）；微粒硅膠（中國科學院蘭州化物所）：球形，粒度5～7μm，比表面積110m2/g，平均孔徑6.7nm；微晶纖維素（上海試劑四廠）；3氨基丙基三乙氧基硅烷（KH550，遼寧蓋縣化工廠）。所用試劑均為分析純，流動相重蒸后使用。6種三唑類手性農藥由中國農業(yè)大學農藥殘留分析組提供。

　　2.2手性固定相的合成參照文獻的方法合成手性固定相CDMPC和ADMPC，于37MPa壓力下裝入不銹鋼柱。

　　2.3色譜條件色譜柱：CDMPCCSP（250mm×4.6mm），ADMPCCSP（150mm×4.6mm）；流動相為甲醇水或乙腈水；流速為0.8mL/min（CDMPC）和0.5mL/min（ADMPC）；進樣量10μL，檢測波長230nm。容量因子（k）、選擇因子（α）和分離度（Rs）分別按公式k=（t-t0）/t0，α=k2/k1，Rs=2（t2-t1）/（w1 w2）計算。

　　3結果與討論

　　3.1不同固定相及流動相組成對對映體拆分的影響在CDMPCCSP和ADMPCCSP上以甲醇水或乙腈水為流動相對三唑類農藥己唑醇、烯唑醇、烯效唑、粉唑醇、戊唑醇和三唑酮對映異構體進行了直接的手性拆分。在優(yōu)化的色譜條件下，己唑醇、烯唑醇和三唑酮在CDMPC上分離度分別達1.72，1.31和1.55；己唑醇、烯唑醇、粉唑醇、烯效唑和戊唑醇在ADMPC上分離度分別達到1.28，2.75，1.05，2.41和1.30。在同一種固定相、不同的流動相對樣品的保留、立體選擇性也不同。如在ADMPCCSP上，烯唑醇和粉唑醇只能在甲醇水作流動相下拆開，已唑醇則只能在乙腈水作流動相下拆開。甲醇既是質子的受體也是供體；乙腈只是質子的受體。這說明氫鍵不一定是反相條件下拆分的主要作用力。隨著流動相中水含量的增加，分離的可能性增大，但考慮到柱子的壽命和柱效，本實驗中水分含量對于甲醇和乙腈分別達40%和60%。本研究組曾報道在正相色譜條件下，戊唑醇和三唑酮可以在CDMPC上拆分。氫鍵、ππ、偶極偶極作用通常被認為是多糖類固定相在三唑類手性農藥在ADMPCCSP上反相條件下的拆分色譜圖。

　　Fig.2Chromatogramsshowingtheenantiomericseparationoftriazolechiralpesticidesa.己唑醇（Hexaconazole），乙腈/水（ACN/water）45∶55，V/V；b.烯唑醇（Diniconazole），甲醇/水（Methanol/water），80∶20，V/V；c.粉唑醇（Flutriafol），甲醇/水（Methanol/water）70∶30，V/V；d.烯效唑（Uniconazole），乙腈/水（ACN/water）60∶40，V/V；e.戊唑醇（Tebuconazole），乙腈/水（ACN/water），50∶50，V/V；室溫（Roomtemperature）；流速（Flowrate）0.5mL/min。正相色譜條件下拆分的有效作用力；而在反相條件下，強極性流動相更容易與CSP形成強的氫鍵作用，從而減弱了溶質分子與CSP的氫鍵作用，這將可能使分析物在固定相的螺旋型手性空穴中的包容作用和“立體適應性”（Stericfit）、疏水作用、ππ、偶極偶極相互作用成為手性識別的關鍵因素。

　　3.2溫度對對映體拆分的影響在0～40℃范圍內，考察了溫度對三唑類手性農藥對映體拆分的影響。結果表明，所研究的手性農藥對映體的容量因子k隨著溫度的升高而減?。贿x擇因子α沒有一致的規(guī)律；不同農藥的最佳分離度出現在不同的溫度，而不是都出現在低溫。

　　通過測定不同溫度下的容量因子k和手性選擇因子α，以lnk和lnα分別對1/T作圖，各自可以得到一條直線。通過考察溫度對手性分離的影響，可以計算出手性分離過程中的熱力學參數，從而對手性分離過程有更加深入的了解。除了烯效唑的選擇因子的自然對數與絕對溫度的倒數在甲醇作改性劑時在ADMPC上不呈線性關系（圖3），其它手性農藥的van′tHoff曲線都具有線性，計算得到的熱力學參數見表1。戊唑醇在甲醇作改性劑時，在ADMPC上的手性拆分主要受熵控制，而在乙腈作改性劑時主要受焓控制；其它農藥（除烯效唑）手性拆分主要受焓控制。表10～40℃范圍內，手性農藥對映體的Van′tHoff方程和ΔΔH°、ΔΔS°。

　　3.3對映體的流出順序近年來，高效液相色譜圓二色檢測器已成為手性化合物分析的有力工具。本研究利用高效液相色譜圓二色檢測器測定了對映體流出順序（見表2），3種三唑類手性農藥在CDMPCCSP上，2種流動相條件下，同一波長下的流出順序一致；而在ADMPCCSP上，烯效唑與烯唑醇的出峰順序相反，其它手性農藥出峰順序一致。產生這種現象的原因尚不清楚，一般認為是流動相成分的改變導致了手性空腔的立體環(huán)境發(fā)生變化所致。表2三唑類手性農藥在CDMPCCSP和ADMPCCSP上反相條件下對映體流出順序。