熒光顯微鏡檢測原理及方法
加入技術交流群
用于熒光顯微鏡的主要濾板如表1。
表1 熒光顯微鏡常用濾板型號和透光特點
| 基本色調 | 相應名稱 | 2mm厚透光范圍（峰值）nm | |||
| 上海電器元件廠 | 德國（Schott） | 蘇聯 | 日本 | ||
| 黑紫 | ZWB-1 | UG-1 | yΦC-2 | DV-1 | 300～400（365） |
| 黑紫 | ZWB-2 | UG-5 | yΦC-1 | - | 280～240（360） |
| 靛藍 | ZB-2 | BG-1 | ΦC-1 | BG-1 | 300～500（380） |
| 靛藍 | ZB-3 | BG-3 | CC-4 | BG-3 | 260～520（400） |
| 靛藍 | QB-24 | BG-12 | CC-8 | BG-12 | 310～570（420） |
| 淡藍 | QB-10 | BG-38 | C3C-5 | - | 310～720（460） |
| - | QB-12 | - | -8 | - | - |
| - | - | - | -11 | - | - |
| 橙黃 | CB-3 | OG-1（K530） | OC-11 | OG-1 | 530以上 |
| 橙黃 | JB-8 | OG-4（K510） | ЖC-18 | FY-5 | 510以上 |
| 綠橙 | JB-7 | GG-11（K490） | ЖC-17 | FY-3 | 480以上 |
| - | - | - | - | FY-4 | - |
| 淡綠 | JB-4 | GG-3（K430） | жC-11 | US-10 | 420以上 |
紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。
紫外藍光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫藍光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號為QB24（BG12）。
最大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達明色素）可用藍綠濾板（如B-7）激發(fā)。
近年開始采用金屬膜干涉濾板，由于針對性強，波長適當，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達明的S546綠色濾板，均遠比玻璃濾板效果好。
激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些。基本要求是以獲得最明亮的熒光和最好的背景為準。
2．壓制濾板 壓制濾板的作用是完全阻擋激發(fā)光通過，提供相應濾長范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對應，常用以下3種壓制濾板：
紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6 K460。
紫藍光壓制濾板：能通過510nm以上濾長的熒光（綠到紅），能與BG-12組合。通常用OG-4 K510或OG-1 K530。
紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長的熒光（藍到紅），可與BG-3組合，常用OG-11 K470AK 490，K510。
（三）反光鏡
反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見光的藍紫區(qū)吸收少，反射達90%以上，而銀的反射只有70%；一般使用平面反光鏡。
（四）聚光鏡
專為熒光顯微鏡設計制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。
1．明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適于低、中倍放大的標本觀察。
2．暗視野聚光器
暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應用日益廣泛。因為激發(fā)光不直接進入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進入目鏡，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強激發(fā)光的強度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時，可用無色濾板（不透過紫外）而仍然產生黑暗的背景。從而增強了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質量，觀察舒適，可能發(fā)現亮視野難以分辨的細微熒光顆粒。
3．相差熒光聚光器
相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時進行相差和熒光聯合觀察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。
（五）物鏡
各種物鏡均可應用，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長范圍）適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大時其影響非常明顯。因此對熒光不夠強的標本，應使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡（4×,5×，6.3×等）。
評論