參比型SPR生物芯片的檢測

　　1 引言

　　SPR生物傳感器是上個(gè)世紀(jì)末期發(fā)展起來的新型光學(xué)生物傳感器，它可以無標(biāo)記地檢測待測物與芯片上固定分子間的結(jié)合反應(yīng)。SPR生物傳感器可以實(shí)時(shí)監(jiān)測芯片表面發(fā)生的各種結(jié)合、解析反應(yīng)，已經(jīng)成為一種成熟的檢測生物分子間相互作用的方法。

　　靈敏度高是SPR生物傳感器的特點(diǎn)之一，它甚至能測量到由于溫度變化而引起的信號變化。同樣溫度、溶液濃度等非反應(yīng)因素的變化也會引起SPR信號的變化。這樣的過度靈敏性，或者可稱為過敏性，有時(shí)候甚至?xí)绊懳覀儗τ诜磻?yīng)信號的判斷。為了消除這種過敏性就需要進(jìn)行信號補(bǔ)償，而信號補(bǔ)償試驗(yàn)的進(jìn)行又很難保證完全重復(fù)發(fā)生反應(yīng)時(shí)的各種條件，參比型SPR生物芯片的出現(xiàn)解決了這一問題。通過參比信號與檢測信號的比較，可以很容易地知道SPR反應(yīng)曲線的變化是由于生物反應(yīng)的進(jìn)行還是由于外界因素的變化而引起的。

　　2 儀器與芯片

　　實(shí)驗(yàn)中采用的是崔大付課題小組自行研制的單通道雙參數(shù)參比型SPR生物傳感器(圖1，國內(nèi)專利申請?zhí)?00510053510.6)。

　　參比型SPR生物芯片(圖2)是自行制備的一種在金基底上進(jìn)行了葡聚糖修飾的生物芯片。該芯片分為兩個(gè)測量位點(diǎn)，兩個(gè)位點(diǎn)采用不同的修飾方法，其中一個(gè)作為檢測位點(diǎn)，可以與蛋白類物質(zhì)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)從而將配基牢固固定在芯片表面。參比位點(diǎn)也有一層葡聚糖膜，但由于沒有進(jìn)行羧甲基修飾，不會與配基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。參比位點(diǎn)可以發(fā)生等離子體諧振，將流通池內(nèi)溶液的溫度、流速、本體溶液折射率、非特異性吸附等因素都在參比曲線上反映出來。

　　3 實(shí)驗(yàn)方法

　　首先在芯片背面滴一滴香柏油，然后將芯片小心地貼在傳感器的棱鏡表面，注意在芯片與棱鏡間不要有氣泡，然后將流通池對準(zhǔn)光斑安裝好并擰緊。

　　芯片安裝好后，首先向流通池內(nèi)通入HBS緩沖液。角度掃描后在吸收峰的左側(cè)直線部分選擇一點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)監(jiān)測。定點(diǎn)監(jiān)測開始后先進(jìn)行HBS清洗，待檢測與參比曲線的基線穩(wěn)定后，將等體積新鮮混合的EDC和NHS溶液通人流通池內(nèi)活化SPR生物芯片表面的羧基。20 min后HBS清洗，然后通入pH值為4.6，0.5 mg/ml的人IgG溶液至固定信號基本穩(wěn)定。HBS清洗后再通入乙醇胺滅活芯片表面的活性位點(diǎn)。20 min后HBS清洗，然后通入HBS稀釋5倍的效價(jià)為1：10的羊抗人IgG溶液，信號基本穩(wěn)定后HBS清洗。

　　4 結(jié)果與討論

　　試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，圖中曲線分別為檢測曲線和參比曲線?；罨蜏缁顣r(shí)檢測曲線與參比曲線信號均隨著本體溶液的變化而變化。通入人IgG溶液后檢測曲線上的固定信號上升明顯，而參比曲線基本不變;通入羊抗人IgG溶液后檢測信號繼續(xù)上升，而參比信號仍然不變。

　　試驗(yàn)中檢測曲線與參比曲線在活化與滅活時(shí)信號變化趨勢一致，在通入人IgG和羊抗人IgG溶液時(shí)兩者差異明顯，說明了：(1)參比位點(diǎn)沒有固定蛋白，參比區(qū)檢測到的信號為溶液本體折射率發(fā)生變化引起的變化，沒有蛋白的固定與結(jié)合反應(yīng)，具有良好的參比性;(2)檢測位點(diǎn)在活化后可以固定人lgG;(3)羊抗人IgG可以與固定在芯片上的人IgG發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)。

　　5 結(jié) 論

　　羊抗人IgG是人IgG的抗體，該試驗(yàn)是一個(gè)固定抗原檢測抗體的模型。試驗(yàn)的成功表明參比型SPR生物芯片的檢測位點(diǎn)可以固定抗原，固定的抗原可以與溶液中的抗體發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)。參比位點(diǎn)可以發(fā)生等離子諧振，但沒有化學(xué)活性，不會與反應(yīng)過程中的蛋白發(fā)生反應(yīng)，具有良好的參比性。