一招變身檢測(cè)熒光達(dá)人

　　檢測(cè)熒光方法和手段根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求和目的也多種多樣，使用最多的還是熒光顯微鏡，熒光酶標(biāo)儀，流式細(xì)胞儀等。但是，無(wú)論何種儀器，無(wú)論儀器的性能如何，要得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，最基本的條件就是根據(jù)所使用的熒光染料正確設(shè)置激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)。

　　下面我們以熒光顯微鏡的熒光濾色鏡為例，介紹一下濾色鏡組的構(gòu)造以及根據(jù)染料，如何正確選擇濾色片。

　　熒光激發(fā)塊是熒光顯微鏡中用來(lái)激發(fā)熒光標(biāo)本和觀察熒光的核心部件，它實(shí)際是濾色片的組合，一般含有3種濾色片：

　　1. 激發(fā)濾色片（Exciter Filter）：選擇透過(guò)某個(gè)波段的光，來(lái)激發(fā)熒光染料。

　　2. 分色鏡 （Dichroic Mirror）：反射激發(fā)光，透過(guò)熒光，一般激發(fā)光波長(zhǎng)短，而發(fā)射光波長(zhǎng)較長(zhǎng)。

　　3. 發(fā)射濾色片（Barrier Filter） ：透過(guò)發(fā)射光，也就是我們看到的“熒光”。同時(shí)阻擋各種雜散光和激發(fā)光的反射光。

　　根據(jù)熒光觀察的原理——熒光染料吸收特定波長(zhǎng)的光（即激發(fā)光），躍遷到激發(fā)態(tài)，然后再釋放出特定波長(zhǎng)的發(fā)射光（即熒光），回到基態(tài)。由此可知熒光染料所需的激發(fā)光和釋放的熒光都是特定波長(zhǎng)的，所以需要利用各種濾色片來(lái)選擇性的透過(guò)某種特定波長(zhǎng)的光來(lái)實(shí)現(xiàn)熒光觀察。否則，就會(huì)出現(xiàn)激發(fā)不了，激發(fā)了卻看不到或串色的現(xiàn)象。所以選擇合適的濾色片非常重要！

　　下面我們以熒光染料DAPI為例，闡述該如何選擇熒光激發(fā)塊。

　　通過(guò)上圖，我們可以了解到DAPI的激發(fā)光波長(zhǎng)為300nm-410nm左右，激發(fā)峰值在360nm左右，也就是說(shuō)激發(fā)光在300-410nm時(shí)可以激發(fā)DAPI染料，在360nm時(shí)激發(fā)效率最高。發(fā)射光波長(zhǎng)為390nm-600nm，峰值在470nm左右。接著，我們就根據(jù)這些數(shù)據(jù)來(lái)選擇濾色片。

　　上圖為Olympus U-FUW激發(fā)塊的光譜信息。我們可以了解到此激發(fā)塊可以提供的激發(fā)光波長(zhǎng)在300-400nm之間，剛好可以激發(fā)DAPI。允許透過(guò)的熒光光譜范圍也在410nm以上，所以此激發(fā)塊可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)DAPI熒光染料的觀察。