片上實(shí)驗(yàn)室的新進(jìn)展

2004年8月A版

　　當(dāng)前，半導(dǎo)體集成技術(shù)終于轉(zhuǎn)向了90nm線寬工藝，開始進(jìn)入納米領(lǐng)域，預(yù)料今后將再發(fā)展65nm、45nm的細(xì)微加工技術(shù)，人類擁有的細(xì)微加工技術(shù)將真正達(dá)到納米技術(shù)的水平。把這種納米技術(shù)應(yīng)用到生物化學(xué)領(lǐng)域目前極受關(guān)注。

何謂片上實(shí)驗(yàn)室

　　近年來(lái)，把科學(xué)的分析操作集成到像半導(dǎo)體集成電路那樣的幾個(gè)平方厘米的玻璃、硅或塑料等微型薄片上的研究正在蓬勃開展，這在美國(guó)叫做片上實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip),在歐洲稱為MTAS(Micro Total Analysis Systems,微型綜合分析系統(tǒng))。它是指利用細(xì)微加工技術(shù)在玻璃或塑料基板上制作成溶液流動(dòng)的微小通道網(wǎng)絡(luò)，在一只芯片上集成如在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行生化、化學(xué)操作和檢測(cè)。

　　由于其微小，必然具有樣本微量化、反應(yīng)與分析高速化等多種優(yōu)點(diǎn)。其方法雖各有不同，但就其根本目的來(lái)說(shuō)，進(jìn)行的納米級(jí)的化學(xué)及生物高分子等的性質(zhì)和功能分析，或者對(duì)其人工合成與控制則是共通的。為此，今天已應(yīng)用了納米技術(shù)。

片上實(shí)驗(yàn)室與納米技術(shù)

　　關(guān)于應(yīng)用納米技術(shù)及反應(yīng)場(chǎng)微小的效果包括：①因擴(kuò)散而易于產(chǎn)生混合，即反應(yīng)場(chǎng)體積如為1/10，則擴(kuò)散時(shí)間將縮短為1/100；②提高每單位體積的表面積比，這可望熱的進(jìn)出及表面-液體間的相互作用(包含催化劑化學(xué)反應(yīng)等)高效化。③提高通道每單位截面積的周長(zhǎng)比；由于壁面與液體的粘著力的影響比慣性力增加更大，故通道中的液體易形成層流。

　　目前主要是利用①、②效用研究通道中液體與液體界面化學(xué)處理，但如能通過(guò)納米表面結(jié)構(gòu)加工等納米技術(shù)進(jìn)行控制，則可望利用②的效用，開發(fā)固體、液體表面反應(yīng)高效化的反應(yīng)堆。此外，由于nm級(jí)的空間控制可實(shí)現(xiàn)微小空間的精密環(huán)境控制，故有可能發(fā)展如設(shè)計(jì)生物分子之類的制作技術(shù)。

　　此外，如考慮到nm大小的蛋白質(zhì)或其集合體(生物分子機(jī)械、生物納米機(jī))負(fù)有生命的功能，則必須測(cè)量單個(gè)分子或單分子機(jī)械的功能，直接觀察、操作這一測(cè)量的技術(shù)已在開發(fā)中。

片上實(shí)驗(yàn)室對(duì)染色體分析的必要性

　　包含人的遺傳基因信息的全部DNA信息(堿基系列)的人類染色體排序已接近完成。人類染色體計(jì)劃由于DNA排序技術(shù)的顯著進(jìn)展，將比預(yù)定期限更短成功實(shí)現(xiàn)(圖1)。人類已處于后染色體時(shí)代的起點(diǎn)。

　　即使在后染色體時(shí)代，染色體及DNA分析仍然重要。分析每個(gè)人染色體信息差異的SNP分析，分析比較人以外生命的染色體信息來(lái)深刻理解生命現(xiàn)象的比較染色體學(xué)等，都必須由龐大的樣本和信息進(jìn)行歸納或演繹分析，因此，更高速的DNA排序技術(shù)將是不可缺少的。近年來(lái)大受重視的按染色體制藥實(shí)現(xiàn)的定制式醫(yī)療，就需要各個(gè)人的染色體分析。

　　人染色體有約32億個(gè)堿基，1000人的染色體信息就會(huì)有3T個(gè)(T=1012)堿基，地球規(guī)模計(jì)人染色體信息將是18E(E=1018)的天文數(shù)字。要獲得這樣龐大的信息現(xiàn)有技術(shù)將受到限制，只有前所未有的嶄新技術(shù)才有望在后染色體排序時(shí)代發(fā)揮極為重要的作用。

　　作為把握下一代技術(shù)開發(fā)關(guān)鍵的基礎(chǔ)技術(shù)，基于半導(dǎo)體技術(shù)的微納米技術(shù)與提取生命信息的濕化學(xué)技術(shù)的結(jié)合、陣列排布和集成最為重要，片上實(shí)驗(yàn)室在目的及技術(shù)方面將是所追求的，也必將應(yīng)用于染色體分析。在這一背景下，便出現(xiàn)了應(yīng)用細(xì)微加工技術(shù)的DNA芯片及電泳芯片等獨(dú)特的微芯片DNA分析技術(shù)。

DNA芯片與微陣列

　　DNA芯片是把序列各異的許多(幾千至數(shù)萬(wàn)種)DNA片斷排列固定在玻璃或硅基片上，以預(yù)先用螢光試劑標(biāo)準(zhǔn)化的DNA樣本擦該芯片，利用作成DNA互補(bǔ)的雙層螺旋狀的性質(zhì)，用激光束檢測(cè)樣本DNA與DNA芯片上的某種DNA是否產(chǎn)生相互作用(雜混)。

　　DNA在芯片上的固定大致分為化學(xué)結(jié)合型和定位型兩類。通常，把化學(xué)結(jié)合型叫做DNA芯片，而把定位型叫做微陣列。

　　DNA芯片及微陣列最重要的應(yīng)用領(lǐng)域是遺傳基因的顯現(xiàn)分析。在人染色全中，遺傳基因總共有3~4萬(wàn)種，其中實(shí)際起作用(顯現(xiàn))的遺傳基因只有一部分，而且不同的細(xì)胞其顯現(xiàn)遺傳基因不一樣。比如，比較癌細(xì)胞與正常細(xì)胞，若研究癌細(xì)胞中經(jīng)常顯現(xiàn)的遺傳基因或不顯現(xiàn)的遺傳基因，其中就應(yīng)該有把握致癌機(jī)理關(guān)鍵并成為治療對(duì)象的遺傳基因。若知道遺傳基因，便可望大規(guī)模進(jìn)行疾患的診斷和治療了。

　　遺傳基因顯現(xiàn)分析情況下，要知道遺傳基因的顯現(xiàn)，必須知道顯現(xiàn)生成的RNA(傳遞核糖核酸)。首先從細(xì)胞中取出mRNA，利用逆復(fù)寫反應(yīng)配制加入了螢光標(biāo)識(shí)的目標(biāo)cDNA(互補(bǔ)DNA)。將該cDNA雜混在微陣列中，使可用螢光成像分析器檢測(cè)出來(lái)。例如，根據(jù)人癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的微陣列分析結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞間遺傳基因顯現(xiàn)量的不同，通過(guò)對(duì)它們的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，便能發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞中經(jīng)常顯現(xiàn)的遺傳基因。

微芯片電泳

　　DNA的排序方法一般采用圣伽法。圣伽法中DNA片斷的分離最初通過(guò)平板型聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)現(xiàn)。它是在兩塊玻璃板間用凝膠作隔離物。但是在人染色體計(jì)劃中，取代該分離法利用毛細(xì)管電泳進(jìn)行處理，實(shí)現(xiàn)了處理速度的飛躍提高。

　　現(xiàn)在還開發(fā)了在微芯片上的通道中實(shí)現(xiàn)染色體排序的技術(shù)，證明20分鐘即能實(shí)現(xiàn)每個(gè)通道中解讀600堿基的遺傳信息。此種微芯片排序器能達(dá)到現(xiàn)有DNA分析設(shè)備1000倍以上的高速度，是一種極具魅力的新技術(shù)。

　　圖2示出微芯片電泳的概念。首先，在所有流路及各貯液槽(圖2中a凝膠貯液槽)中注入泳動(dòng)緩沖液。其后在樣本貯液槽中加入樣本，如圖2(b)加上電壓，在幾十秒內(nèi)樣本DNA將均勻充滿樣本引入流路。然后如切換所加電壓(圖2(c))，存在于流路接頭部的一定量的樣本將移動(dòng)到分離流路，利用電泳進(jìn)行分離、檢測(cè)。此時(shí)，由于留在樣本引入流路內(nèi)的剩余樣本遠(yuǎn)離流路接頭部，對(duì)外部的貯液槽仍加正電壓，如圖2(d)。

　　圖2右邊是使用了3種DNA混合溶液對(duì)該樣本引入情況的成像。在樣本引入1秒鐘后DNA呈極尖銳的的帶狀進(jìn)入分離通道，到6秒鐘后便看到3種DNA帶狀物開始分離，由于這種樣本引入法的采用，與毛細(xì)管電泳不一樣，能達(dá)到定量的樣本引入。

DNA單分子分析的挑戰(zhàn)

　　利用微芯片電泳之各種方法雖能進(jìn)行DNA排序的高速化，但如考慮將來(lái)染色體醫(yī)療等后染色體研究(參見圖1)，必須有提取龐大達(dá)E級(jí)的堿基序列信息的排序技術(shù)。為實(shí)現(xiàn)DNA排序的全新高速化，正在挑戰(zhàn)DNA單分子分析，目前雖在研究階段，但研究甚為活躍。試舉意味深品的一例。

　　據(jù)哈佛大學(xué)的Branton等稱，已試驗(yàn)過(guò)DNA單分子通過(guò)納米的排序，由D-溶血素葡萄球菌的蛋白質(zhì)毒素)自身作用形成直徑1.4nm的納米孔，在具有此種納米孔通道的脂質(zhì)雙層膜兩邊加電壓，此時(shí)電解質(zhì)在溶液中溶解，由于通過(guò)納米孔的離子傳導(dǎo)，便有微微安級(jí)電流流過(guò)。當(dāng)帶負(fù)電的DNA分子被拉向陽(yáng)極時(shí)，堵塞了作為離子通道的納米孔，離子傳導(dǎo)受到限制，從而檢測(cè)出電流值的改變。

　　根據(jù)通過(guò)的堿基種類A、T、C、G產(chǎn)生的電流值變化，便可實(shí)現(xiàn)排序。由于DNA分子的毫秒級(jí)通過(guò)納米孔，基實(shí)現(xiàn)就可能達(dá)到高速排序。迄今已在聚腺嘌呤與聚胞嘧啶之間發(fā)現(xiàn)了電流值變化的差異。但為了排序，還需要靈敏度更高的檢測(cè)器等，尚有許多必須改進(jìn)之處。

走向高度集成系統(tǒng)

　　所介紹的電泳芯片已開始有設(shè)備出售了，微芯片技術(shù)為了更大提高處理能力，正在發(fā)展成為把從細(xì)胞的DNA提取、PCR(聚合酶連鎖反應(yīng))等反應(yīng)、電泳、雜混、激光誘發(fā)螢光檢測(cè)、電化學(xué)檢測(cè)、熱透鏡顯微鏡檢測(cè)等染色體分析所必需的所有基本處理，集成到幾平方厘米的微芯片上的集成型微芯片。

　　而且，隨著集成化技術(shù)的急速進(jìn)步，細(xì)微加工將從微米領(lǐng)域轉(zhuǎn)向納米領(lǐng)域。代替過(guò)去用作DNA分離媒體的凝膠和聚合物，而把采用納米細(xì)微加工技術(shù)作成的納米柱配置在微通道中，實(shí)現(xiàn)不同凝膠或聚合物的DNA及蛋白質(zhì)的分離，開發(fā)出微芯片上具有各種納米結(jié)構(gòu)的器件，并實(shí)現(xiàn)極微量或單分子DNA或蛋白質(zhì)提取、放大、排序、多項(xiàng)檢測(cè)等集成化超高速分析技術(shù)。這樣的納米芯片技術(shù)也在進(jìn)行研究。

　　DNA分析中各種處理迄今都進(jìn)行了高速化的研究，但通過(guò)如圖6所示把所有處理微化、集成在同一芯片上，由于能激劇縮短各處理花費(fèi)的時(shí)間，便可望使整個(gè)過(guò)程大大高速化，這才將真正進(jìn)化到“片上實(shí)驗(yàn)室”。(蔡)